Sự phát sinh phôi soma bất định
Các phôi vô tính có thể phát triển từ các tế bào hay các mô sẹo có liên quan của một số loài thực vật nhiệt đới. Các phôi bất định có thể đƣợc tạo trực tiếp từ tế bào đơn trên bề mặt của phôi non hoặc gián tiếp từ bề mặt của phôi non này. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng trong chƣơng trình di truyền cải tạo giống, chẳng hạn nhƣ: cứu các phôi bị chết non do lai tạo.
Sự phát sinh đa phôi vô tính
Hiện tƣợng này xảy ra khi nuôi cấy các noãn non của thực vật hạt trần. Các khối mô có khả năng tạo phôi cao, khi đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng mới sẽ phát triển và tăng trƣởng thành phôi. Mô có khả năng phát triển thành phôi có thể đƣợc phân biệt với mô không có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và hóa đỏ khi nhuộm bằng acetocarmine. Dƣới ánh đèn tử ngoại các tế bào phôi có thể phát huỳnh quang màu xanh lá cây.
Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng
Hiện tƣợng này do sự nuôi cấy lỏng các tế bào và mô sẹo sau khi các mô này chịu các xử lý đặc biệt đem lại sự cảm ứng khả năng tạo phôi. Ngƣời ta đã thực hiện nhiều nghiên cứu trên nhiều lọai thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau để quan sát khả năng tạo thành mô sẹo.
2.5. Vai trò của chất điều hòa sinh trƣởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.5.1. Chất điều hoà sinh trƣởng
Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trƣởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Chúng không phải là các chất dinh dƣỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật.
Về đại cƣơng các chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc chia làm hai nhóm: các chất kích thích sinh trƣởng và các chất ức chế sinh trƣởng. Trong nuôi cấy in vitro thì sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trƣởng với nhau là điều cần thiết.
2.5.2. Một số chất điều hoà sinh trƣởng thƣờng dùng trong nuôi cấy mô
Hiện nay 3 nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thƣờng đƣợc dùng: auxin, cytokinin và gibberellin.
Auxin
Auxin tự nhiên là một nhóm các chất đƣợc tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, đƣợc vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trƣởng của tế bào. Auxin bị phân hủy bởi ánh sáng, có tính phân cực. Ví dụ nhƣ: IAA (indolacetic acid), IBA (indolbultyric acid), NAA (napthtalene acetic acid), 2,4D (dichlophenoxy acetic acid) (Vũ Văn Vụ, 2000).
Chức năng của auxin: Kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to ra, làm tăng kích thƣớc của các cơ quan, ảnh hƣởng đến sự phân chia tế bào, kích thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành tế bào nhƣ cellolose, pectin. Điều chỉnh tính hƣớng động của cây: quang hƣớng động và địa hƣớng động. Gây ra hiện tƣợng ƣu thế ngọn đƣợc giải thích bằng việc ức chế sinh trƣởng của chồi bên khi auxin đƣợc vận chuyển từ ngọn xuống dƣới. Kích thích sự hình thành rễ. Kích thích sự hình thành quả, sự lớn của quả, tạo nên quả đơn tính không hạt và kiềm hãm sự rụng lá, hoa, quả. Tạo phôi trong nuôi cấy huyền phù.
Các phản ứng auxin và sự tăng trƣởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, RNA và chuyển hóa protein không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý.
Một đặc trƣng quan trọng của auxin là tác động chủ yếu lên vách tế bào (Torry và csv, 1981). Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+
, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giãn nở tế bào (Roger Prat, 1993).
Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, cenllulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981; Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002).
Cytokinin
Cytokinin hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ thực vật. Ngoài ra, một số cơ quan còn non đang sinh trƣởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin nhƣ chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh. Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ, 2003). Cytokinin đƣợc sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Những cytokinin thƣờng gặp nhất là: Kinetin (6 Furfuril aminopurin), BA (6-Benzyl aminopurin), TDZ (thidiazuron).
Đặc điểm của cytokinin: Cytokinin đƣợc vận chuyển trong cây không phân cực nhƣ auxin, có thể hƣớng ngọn và hƣớng gốc. Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng nhƣ các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải bằng các enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê. Các cytokinin thƣờng dùng trong nuôi cấy mô: kinetin, BA, và PBA.
Chức năng của cytokinin: Vai trò sinh lý đặc trƣng của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào. Ảnh hƣởng lên sự hình thành và phân hóa cơ quan đặc biệt là phân hóa chồi. Kìm hãm quá trình hóa già của các cơ quan và của toàn cây, kìm hãm sự phân hủy của diệp lục, protein và acid nucleic.
Phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng sự nở hoa. Điều chỉnh hiện tƣợng ƣu thế ngọn. Ảnh hƣởng đến sự hoạt động sinh lý của cây do nó có ảnh hƣởng đến các quá trình trao đổi chất. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinh trƣởng trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bƣớu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và csv, 1985; Taiz L. và csv, 1991).
Trong những nghiên cứu gần đây về tạo phôi vô tính thực vật ngƣời ta thấy rằng việc kết hợp nồng độ auxin và cytokinin ở những nồng độ và tỷ lệ thích hợp sẽ có khả năng khích thích tạo thành phôi vô tính. Hiện nay nhiều nghiên cứu sử dụng TDZ (chất điều hoà tăng trƣởng thuộc nhóm cytokinin) có hoạt tính mạnh nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001).
Gibberellin
Gibberellin là nhóm phytohoocmon thứ 2 đƣợc phát hiện sau auxin, từ việc nghiên cứu bệnh lý “bệnh lúa von”. Năm 1926, Kurosawa (Nhật bản) đã thành công trong thí nghiệm gây bệnh von nhân tạo cho cây lúa và ngô. Yabuta (1934-1938) tách đƣợc 2 chất dƣới dạng tinh thể từ nấm lúa von gọi là gibberellin A và B, nhƣng chƣa xác định đƣợc bản chất hoá học của chúng. Năm 1955, hai nhóm nghiên cứu Anh và Mỹ phát hiện ra axit gibbellic ở cây lúa von và xác định công thức hoá học của nó (C19H22O6). Năm 1956, West, Phiney, Radley tách đƣợc gibberellin từ thực vât bậc cao và phát hiện trên 50 gibberellin và kí hiệu A1, A2, … A52 hoặc GA1, GA2, …GA52, trong đó A3 có hoạt tính mạnh nhất. Các gibberellin khác nhau chủ yếu ở vị trí nhóm –OH trong phân tử. GA đƣợc tổng hợp ở trong phôi đang sinh trƣởng, trong các cơ quan đang sinh trƣởng khác nhau nhƣ lá non, rễ non, quả non.
Vai trò sinh lý: Kích thích mạnh mẽ sự sinh trƣởng kéo dài của thân, sự vƣơn dài của lóng cây họ lúa, ảnh hƣởng lên sự sinh trƣởng các đột biến lùn. Sử dụng GA ngoại sinh để cây phát triển bình thƣờng. Kích thích sự nẩy mầm của hạt và củ. Kích thích sự ra hoa, ảnh hƣởng đặc trƣng lên sự ra hoa là sự sinh trƣởng kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa. Ảnh hƣởng sự phân hoá giới tính: ức chế sự phát triển hoa cái và kích thích sự phát triển hoa đực. Làm tăng kích thƣớc của quả, tạo quả không hạt.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng đƣợc dùng để thí nghiệm là cây tiêu giống Vĩnh Linh in vitro có sẵn trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài đƣợc tiến hành tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Khoa Nông Học – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh và Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt trong thời gian từ tháng 3 năm 2007 đến tháng 8 năm 2007.
3.3. Vật liệu nghiên cứu
3.3.1. Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy 3.3.1.1. Phòng chuẩn bị môi trƣờng 3.3.1.1. Phòng chuẩn bị môi trƣờng
Nồi hấp: hấp vô trùng môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy, tủ lạnh bảo quản hóa chất và môi trƣờng dự trữ, bể rửa chai, ống nghiệm, bếp điện, cân phân tích, máy khuấy từ, máy đo pH và bình 250 ml.
3.3.1.2. Phòng cấy
Tủ cấy vô trùng, đèn cực tím, giá, bàn để môi trƣờng và mẫu cấy, các dụng cụ cấy gồm: dao cấy, kéo, pince, đèn cồn, bình phun và bông gòn tất cả đã đƣợc hấp vô trùng.
3.3.1.3. Phòng cấy nấm
Tủ cấy nấm, đèn cực tím và các dụng cụ cấy gồm: dao, que cấy, đèn cồn, bình phun, giấy thấm.
3.3.1.4. Phòng tăng trƣởng
Kệ đặt chai hoặc ống nghiệm nuôi cấy (0,6 x 2 m), trên mỗi kệ đều lắp đèn huỳnh quang dài 1,2 m.
Máy điều hòa nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 ± 20C, nhiệt kế để đo nhiệt độ phòng nuôi cây, ẩm kế để đo độ ẩm của phòng nuôi cây.
3.3.2. Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy
Mẫu cấy: Mô sẹo và chồi của cây tiêu Vĩnh Linh
Điều kiện nuôi cấy: cƣờng độ ánh sáng 50 µmol/m2/s. Nhiệt độ 26 2oC và ẩm độ 60 – 80%. Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày.
3.3.3. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm là:
MS (Murashige và Skoog, 1962), gồm các thành phần sau:
Nguyên tố đa lượng
NH4NO3 1650 mg/l KNO3 1900 mg/l MgSO4.7H2O 370 mg/l KH2PO4 170 mg/l CaCl2.2H2O 440 mg/l Vitamins Inositol 100 mg/l Nicotinic 0,5 mg/l Pyridoxin HCl 0,5 mg/l Thiamin HCl 0,1 mg/l Glyxin 2 mg/l Nguyên tố vi lượng H3BO3 6,2 mg/l MnSO4.4H2O 22,5 mg/l ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l KI0,83 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l CoCl2.6H2O 0,025 mg/l Fe EDTA FeSO4.7H2O 27,8 mg/l Na2 EDTA.2H2O 37,3 mg/l Các chất khác:
Đƣờng sucrose: 30 g/l, agar: 8,5 g/l và pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8
Các chất điều hòa sinh trưởng: BA (N6-benzyladenine), IBA (Indole-3- butyric acid), TDZ (Thidiazuron), 2,4D (Dichlophenoxy acetic acid).
3.3.4. Các công thức xử lý chiếu xạ
Đồng vị phóng xạ nhân tạo Co60 đƣợc sử dụng là nguồn phát xạ gamma tại viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt.
Tia γ có bản chất sóng điện từ, có bƣớc sóng ngắn nên không bị lệch hƣớng khi đi qua điện từ trƣờng và có khả năng đâm xuyên rất lớn.
Trong xử lý phóng xạ ngƣời ta dùng hai đơn vị để đo lƣờng phóng xạ:
Rad: để đo năng lƣợng hấp thụ. Rad là liều lƣợng bức xạ bất kỳ loại nào tạo ra trong môi trƣờng vật chất mà tia phóng xạ đó truyền qua.
Roentgen (Г): đơn vị dùng để đo năng lƣợng phát xạ của tia ion có bản chất là sóng điện từ (tia X và tia γ)
Tại viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt vào thời điểm tiến hành thí nghiệm cuối tháng 06/2007 máy phát xạ tia γ hoạt động với các thông số sau:
Suất liều phát xạ tại chỗ: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Liều đỉnh : 13,38 rad/giây. Liều trung tâm : 19,22 rad/giây. Liều đáy : 18,78 rad/giây.
Liều dịch chuyển
Liều đỉnh : 246,27 rad/giây Liều trung tâm : 396,27 rad/giây Liều đáy : 346,27 rad/giây
Dung tích buồng chiếu là 4 lít. Chiều cao 24 cm, đƣờng kính 15 cm.
Các ứng dụng và tính toán đƣợc dựa trên cơ sở suất liều phát xạ trung tâm và liều dịch chuyển trung tâm, công thức tính thời gian xử lý mẫu nhƣ sau:
T = Liều cần chiếu (rad) – Liều dịch chuyển (rad) / Suất liều phát xạ (rad/ giây) T: thời gian mẫu cần đƣợc xử lý (giây)
Trong đó:1 Gy = 100 rads. Vậy khi chiếu liều xạ: 200 Gy thì mất 17 phút 150 Gy thì mất 12,67 phút 100 Gy thì mất 8,33 phút 20 Gy thì mất 1,39 phút 40 Gy thì mất 3,12 phút 60 Gy thì mất 4,86 phút
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy
Pha môi trƣờng MS (Murashige & Skoog) bổ sung nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng BA, IBA, TDZ, 2,4-D khác nhau tùy theo từng nghiệm thức.
Môi trƣờng đƣợc cho vào bình nuôi cấy có dung tích là 250 ml, mỗi bình chứa 30 ml môi trƣờng hấp ở 121oC; 1,2 atm trong 25 phút.
3.4.2. Nội dung nghiên cứu
3.4.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora capsici đến sinh
trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu
Phƣơng pháp thí nghiệm
Phƣơng pháp tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro
Tạo mô sẹo từ lá cây tiêu trên môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 3 mg/l BA. Quá trình hình thành mô sẹo sẽ xảy ra trong bóng tối và mô sẹo đƣợc tạo thành từ những vết thƣơng trong quá trình cắt mẫu lá.
Sử dụng cây tiêu nuôi cấy in vitro, lấy mẫu lá cắt nhỏ thành những mẫu nhỏ (0,4 cm x 0,4 cm). Đặt vào môi trƣờng sao cho mặt dƣới lá tiếp xúc với môi trƣờng. Mỗi chai cấy 4 - 5 mẫu lá nhỏ. Sau đó, để vào trong bóng tối trong 2 tuần, khi từ những vết cắt bắt đầu xuất hiện sự sùi mô sẹo thì lấy ra để ngoài ánh sáng nhẹ (50 µmol/m2/s) để mô sẹo tiếp tục phát triển.
Lấy mô sẹo để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Quá trình tạo mô sẹo đƣợc tiến hành trong điều kiện: Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng: khoáng MS có bổ sung 8,5 g/l agar và 8,5 g/l đƣờng saccharose, 1 mg/l 2,4-D, 3 mg/l BA. Môi trƣờng đã đƣợc khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút. pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8. Thể tích môi trƣờng: 30 ml. Cƣờng độ ánh sáng: Tối hoàn toàn trong 2 tuần đầu, 3 tuần sau đó cƣờng độ ánh sáng là 50 µmol/m2
/s. Nhiệt độ: 25 ± 20C và ẩm độ: 65 ± 5%.Thời gian theo dõi thí nghiệm: 5 tuần
Phƣơng pháp nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora capsici
Giống nấm Phytophthora capsici sử dụng trong thí nghiệm là giống nấm đã đƣợc phân lập tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Nấm Phytophthora capsici đƣợc cấy và nuôi trong môi trƣờng CRA (môi trƣờng dinh dƣỡng cho nấm phát triển gồm: Cà rốt, CaCO3 và agar) 48 giờ. Sau đó đƣợc nuôi trong dung dịch nuôi cấy cà rốt 20%, để trong bóng tối từ 48-72 giờ. Rửa sạch và tiếp tục nuôi ngoài sáng trong nƣớc cất trong 2 - 3 ngày.
Lọc nấm bằng vải lọc rồi lọc bằng giấy lọc và sau cùng là lọc bằng đầu lọc vô trùng với màng lọc có kích thƣớc 0,45 µm để lấy dịch nuôi cấy nấm tiến hành thí nghiệm.
Nấm Phytophthora capsici đƣợc nuôi trong điều kiện: Nấm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng CRA: môi trƣờng gồm cà rốt, CaCO3 và agar khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút. Thể tích môi trƣờng trên đĩa petri 10 ml. Nhiệt độ phòng và ẩm độ: 65 ± 5%. Thời gian theo dõi thí nghiệm: 10 ngày.
Chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy tạo mô sẹo
Pha môi trƣờng MS lỏng có bổ sung 1 mg/l 2,4D và 3 mg/l BA hấp khử trùng. Lấy dịch nấm đã đƣợc vô trùng bằng đầu lọc vô trùng cho vào môi trƣờng thí nghiệm. Sau đó, cho môi trƣờng lỏng vào chai nuôi cấy 250 ml có sẵn một lớp bông gòn ở trong sao cho môi trƣờng vừa ngập qua miếng bông là đƣợc.
Mô sẹo nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung dịch chiết thực hiện trong điều kiện: Cƣờng độ ánh sáng 50 µmol/m2/s, mô sẹo đƣợc cấy trên môi trƣờng lỏng MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l và BA 3 mg/l với nồng độ dịch nấm là 0, 20, 30 và 40%. Nhiệt độ: 25 ± 20 C và ẩm độ: 65 ± 5%. Đặt trên máy lắc trong suốt quá trình thí nghiệm. Thời gian theo dõi thí nghiệm 3 tuần.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});