2.3.6.1. Ngoài nƣớc
Phƣơng pháp gây đột biến gene bằng tia phóng xạ đã đƣợc nghiên cứu từ lâu. Năm 1925, Muller đã tiến hành thành công những công trình nghiên cứu thực nghiệm bằng tia X trên thực vật và trên vi khuẩn và đã tìm ra đƣợc những sinh vật biến dị nổi bật. Vì vậy năm 1925 đƣợc xem là năm ra đời ngành di truyền học phóng xạ.
Ở Mỹ, Humphrey (1951), Rauling (1958), William (1960) và ở Đức, Jashchariss (1956) sau khi nghiên cứu xử lý tia phóng xạ trên cây trồng đều đi đến kết luận: "Tia phóng xạ đã làm thay đổi các đặc điểm sinh trƣởng, phát dục, hình thái tế bào, vật chất di truyền, đồng thời làm xuất hiện những biến dị có hại, có lợi hoặc trung tính trên nhiều loại cây trồng". Đa số các thí nghiệm đã chọn và thu các biến dị có lợi nhƣ: rút ngắn thời gian sinh trƣởng, tăng năng suất, tăng tính kháng sâu bệnh, ít đổ ngã, thấp cây, phân cành nhiều, tăng số lƣợng hoa, đổi màu hoa, tăng trọng lƣợng hoa.
Năm 1964, tổ chức phối hợp FAO/IAEA (Cơ quan lƣơng nông liên hiệp quốc/ Cơ quan nguyên tử năng quốc tế) đƣợc thành lập và tổ chức này đã công bố 1.019 giống đột biến ở những cây có hạt đƣợc đƣa vào sản xuất và 523 giống đột
biến ở những cây sinh sản vô tính và các cây làm cảnh khác nhau. Nhiều loại cây trồng quan trọng có số đột biến lớn nhƣ: Đại mạch, Lúa, Lúa mì mềm, Đậu phộng, Đậu nành, Lúa mì cứng, Đậu Hà Lan, Bông vải, Kiều mạch và rất nhiều giống hoa khác nhau.
Năm 2002, nhóm khoa học của Jammala Machaiah và Mrinal Pednekar, tại Trung tâm Nguyên tử Bhabha (Ấn Độ), đã dùng tia gamma yếu khử gần hết các thành tố axit oligosacharide dƣới vỏ đậu Hà Lan và còn rất nhiều nghiên cứu trên thế giới về ảnh hƣởng của tia gamma trên thực vật.
2.3.6.2. Trong nƣớc
Tại Việt Nam từ năm 1965 – 1970 các nghiên cứu chọn giống đột biến cây trồng đƣợc bắt đầu thực hiện ở Đại học Tổng Hợp Hà Nội. Sau đó, các cơ sở nghiên cứu khác nhƣ: Viện khoa học Việt Nam, Viện khoa học nông nghiệp, Viện di truyền học, Viện cây lƣơng thực và thực phẩm, các trƣờng Đại học nông nghiệp tiến hành thí nghiệm với tia gamma trên những đối tƣợng cây trồng khác nhau.
Năm 1968, Đại học nông nghiệp I (Hà Nội) đã xử lý phóng xạ Co60 trên đậu nành, thu đƣợc một số dòng có triển vọng nhƣ: M103, A75, A9 có năng suất cao. Năm 1977, Đại học nông nghiệp IV xử lý tia γ (Co60) trên giống đậu nành Santamaria tạo đƣợc hai giống: A1, A5 có năng suất cao, rút ngắn thời gian sinh trƣởng. Gần đây, Việt Nam có nhiều nghiên cứu đáng chú ý về ảnh hƣởng của tia gamma lên cây trồng nhƣ các nghiên cứu:
Nguyễn Văn Vinh, 2002. Nghiên cứu chiếu xạ gây đột biến hom mía
(Viện Khoa Học Kỹ Thuật Hạt Nhân).
Hoàng Hƣng Tiến, 2003. Nghiên cứu phóng xạ kích thích hạt giống sắn mì (Trung Tâm Kỹ Thuật Hạt Nhân).
Nguyễn Tiến Thịnh, 2004. Nghiên cứu chiếu xạ gamma liều thấp lên mẫu khoai tây giống (Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt).
Ở Viện Khoa Học Miền Nam, 2004. Nghiên cứu gây đột biến giống Lan bằng tia gamma.
Nguyễn Thị Lang và Lê Xuân Thám, 2004. Nghiên cứu chiếu xạ gây đột biến giống lúa khô.
Một số nghiên cứu về chiếu xạ kích thích hạt giống hoa Kiết Tƣờng; ảnh hƣởng tia phóng xạ γ trên hoa Lily.
Trần Thanh Hân, 2005. Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo cây khoai tây và ảnh hưởng kích thích sinh trưởng của bức xạ gamma liều thấp.
Lê Văn Hòa , 2006. Nghiên cứu : "Xác đi ̣nh khả năng gây đột biến giống hoa lan cắt cành (Dendrobium sp.) bằng colchicine và tia gamma" (Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng).
Hiện nay, các đề tài khoa học nghiên cứu về ảnh hƣởng của tia gamma đến kiểu hình, khả năng kích thích sinh trƣởng trên đậu nành, lúa, bắp và những cây trồng khác đang tiếp tục đƣợc nghiên cứu. Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm áp dụng phƣơng pháp chiếu xạ tạo đột biến đa dạng trên hệ nuôi cấy in vitro
nhiều cây trồng nhƣ khoai lang, khoai tây, dâu tằm, chuối, hoa cẩm chƣớng, hoa hồng, địa lan, cúc. Tuy nhiên kết quả thu đƣợc còn hạn chế (tài liệu của Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt năm 2002 – 2006).
2.4. Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.4.1. Khái niệm
Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật không bị nhiễm vi sinh vật, đƣợc đặt trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh đƣợc phân chia và cấy chuyền để nhân giống.
2.4.2 Ứng dụng
Kỹ thuật này thể hiện một số ƣu điểm đã đƣợc ứng dụng: Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh, tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh, cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến, sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn, lai xa qua nuôi cấy phôi và noãn, lai tế bào soma và tạo dòng protoplast, cải biến tính thực vật qua hấp thụ DNA ngoại lai, cố định nitrogen, cải thiện hiệu quả quang tổng hợpvà bảo quản nguồn gen quý.
Trong giai đoạn hiện nay, nuôi cấy mô thực vật đƣợc ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học. Các vấn đề cơ bản về đời sống của mô và tế bào đơn trong môi trƣờng nhân tạo, nhu cầu về khoáng, vitamin, chất điều hòa sinh trƣởng, nguồn carbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng ngày càng đƣợc hiểu sâu sắc hơn.
2.4.3. Phƣơng pháp nhân phôi vô tính 2.4.3.1. Khái niệm 2.4.3.1. Khái niệm
Sự sinh phôi từ tế bào soma là một quá trình, qua đó một hay vài tế bào soma, trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật), có thể dấn thân vào một sự phân chia theo một trật tự nhất định để cho một phôi, theo kiểu giống hay gần giống nhƣ kiểu sinh phôi từ hợp tử (Bùi Trang Việt, 1994).
2.4.3.2. Ý nghĩa nuôi cấy mô phôi vô tính
Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lƣợng lớn thực vật bằng bioreactor. Tạo hạt nhân tạo, là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật và mở ra nhiều triển vọng mới trong công nghệ nuôi cấy tế bào.
2.4.3.3. Sự hình thành phôi vô tính
Sự tạo phôi soma đƣợc thực hiện lần đầu tiên vào năm 1958 bởi Steward và Reinert. Tuy nhiên khoảng 20 năm sau mới có những nghiên cứu để có thể làm rõ cơ chế của sự sinh phôi vì sự phát sinh phôi soma chỉ xảy ra invitro với tần suất thấp và không đồng nhất trong những hệ thống nuôi cấy. Để có thể nghiên cứu sự phát sinh phôi soma ở mức độ phân tử cần phải thiết lập một hệ thống nuôi cấy đồng nhất và có hiệu suất cao.
Sự hình thành phôi vô tính là quá trình tạo ra tế bào có khả năng sinh phôi giúp cho việc nhân dòng thực vật một cách nhanh chóng. Trong quá trình này, một tế bào đơn có thể đƣợc cảm ứng trở thành một phôi và từ đó phát triển thành cây nguyên vẹn (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002).
Tế bào có khả năng sinh phôi là những tế bào đẳng kín, nhân to, tế bào chất đậm đặc và nhiều hạt tinh bột. Những tế bào này có hàm lƣợng protein và RNA cao (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Sự hình thành phôi vô tính trải qua hai giai đọan:
Sự hình thành phôi vô tính có thể qua 2 con đƣờng là trực tiếp và gián tiếp: Phôi vô tính trực tiếp: đƣợc hình thành từ một tế bào hay một nhóm tế bào mà không thông qua sự hình thành callus. Phôi vô tính gián tiếp: đƣợc hình thành chủ yếu từ callus. Có 2 bƣớc dẫn đến sự hình thành phôi: Sự biệt hóa của tế bào có khả năng phát sinh phôi và sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành thông qua các giai đoạn sau: phôi hình cầu, phôi hình trái tim và phôi hình cá đuối.
2.4.3.4. Các kiểu phát sinh phôi soma
Sự phát sinh phôi soma bất định
Các phôi vô tính có thể phát triển từ các tế bào hay các mô sẹo có liên quan của một số loài thực vật nhiệt đới. Các phôi bất định có thể đƣợc tạo trực tiếp từ tế bào đơn trên bề mặt của phôi non hoặc gián tiếp từ bề mặt của phôi non này. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng trong chƣơng trình di truyền cải tạo giống, chẳng hạn nhƣ: cứu các phôi bị chết non do lai tạo.
Sự phát sinh đa phôi vô tính
Hiện tƣợng này xảy ra khi nuôi cấy các noãn non của thực vật hạt trần. Các khối mô có khả năng tạo phôi cao, khi đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng mới sẽ phát triển và tăng trƣởng thành phôi. Mô có khả năng phát triển thành phôi có thể đƣợc phân biệt với mô không có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và hóa đỏ khi nhuộm bằng acetocarmine. Dƣới ánh đèn tử ngoại các tế bào phôi có thể phát huỳnh quang màu xanh lá cây.
Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng
Hiện tƣợng này do sự nuôi cấy lỏng các tế bào và mô sẹo sau khi các mô này chịu các xử lý đặc biệt đem lại sự cảm ứng khả năng tạo phôi. Ngƣời ta đã thực hiện nhiều nghiên cứu trên nhiều lọai thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau để quan sát khả năng tạo thành mô sẹo.
2.5. Vai trò của chất điều hòa sinh trƣởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.5.1. Chất điều hoà sinh trƣởng
Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trƣởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Chúng không phải là các chất dinh dƣỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật.
Về đại cƣơng các chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc chia làm hai nhóm: các chất kích thích sinh trƣởng và các chất ức chế sinh trƣởng. Trong nuôi cấy in vitro thì sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trƣởng với nhau là điều cần thiết.
2.5.2. Một số chất điều hoà sinh trƣởng thƣờng dùng trong nuôi cấy mô
Hiện nay 3 nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thƣờng đƣợc dùng: auxin, cytokinin và gibberellin.
Auxin
Auxin tự nhiên là một nhóm các chất đƣợc tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, đƣợc vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trƣởng của tế bào. Auxin bị phân hủy bởi ánh sáng, có tính phân cực. Ví dụ nhƣ: IAA (indolacetic acid), IBA (indolbultyric acid), NAA (napthtalene acetic acid), 2,4D (dichlophenoxy acetic acid) (Vũ Văn Vụ, 2000).
Chức năng của auxin: Kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to ra, làm tăng kích thƣớc của các cơ quan, ảnh hƣởng đến sự phân chia tế bào, kích thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành tế bào nhƣ cellolose, pectin. Điều chỉnh tính hƣớng động của cây: quang hƣớng động và địa hƣớng động. Gây ra hiện tƣợng ƣu thế ngọn đƣợc giải thích bằng việc ức chế sinh trƣởng của chồi bên khi auxin đƣợc vận chuyển từ ngọn xuống dƣới. Kích thích sự hình thành rễ. Kích thích sự hình thành quả, sự lớn của quả, tạo nên quả đơn tính không hạt và kiềm hãm sự rụng lá, hoa, quả. Tạo phôi trong nuôi cấy huyền phù.
Các phản ứng auxin và sự tăng trƣởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, RNA và chuyển hóa protein không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý.
Một đặc trƣng quan trọng của auxin là tác động chủ yếu lên vách tế bào (Torry và csv, 1981). Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+
, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giãn nở tế bào (Roger Prat, 1993).
Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, cenllulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981; Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002).
Cytokinin
Cytokinin hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ thực vật. Ngoài ra, một số cơ quan còn non đang sinh trƣởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin nhƣ chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh. Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ, 2003). Cytokinin đƣợc sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Những cytokinin thƣờng gặp nhất là: Kinetin (6 Furfuril aminopurin), BA (6-Benzyl aminopurin), TDZ (thidiazuron).
Đặc điểm của cytokinin: Cytokinin đƣợc vận chuyển trong cây không phân cực nhƣ auxin, có thể hƣớng ngọn và hƣớng gốc. Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng nhƣ các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải bằng các enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê. Các cytokinin thƣờng dùng trong nuôi cấy mô: kinetin, BA, và PBA.
Chức năng của cytokinin: Vai trò sinh lý đặc trƣng của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào. Ảnh hƣởng lên sự hình thành và phân hóa cơ quan đặc biệt là phân hóa chồi. Kìm hãm quá trình hóa già của các cơ quan và của toàn cây, kìm hãm sự phân hủy của diệp lục, protein và acid nucleic.
Phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng sự nở hoa. Điều chỉnh hiện tƣợng ƣu thế ngọn. Ảnh hƣởng đến sự hoạt động sinh lý của cây do nó có ảnh hƣởng đến các quá trình trao đổi chất. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinh trƣởng trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bƣớu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và csv, 1985; Taiz L. và csv, 1991).
Trong những nghiên cứu gần đây về tạo phôi vô tính thực vật ngƣời ta thấy rằng việc kết hợp nồng độ auxin và cytokinin ở những nồng độ và tỷ lệ thích hợp sẽ có khả năng khích thích tạo thành phôi vô tính. Hiện nay nhiều nghiên cứu sử dụng TDZ (chất điều hoà tăng trƣởng thuộc nhóm cytokinin) có hoạt tính mạnh nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001).
Gibberellin
Gibberellin là nhóm phytohoocmon thứ 2 đƣợc phát hiện sau auxin, từ việc nghiên cứu bệnh lý “bệnh lúa von”. Năm 1926, Kurosawa (Nhật bản) đã thành công trong thí nghiệm gây bệnh von nhân tạo cho cây lúa và ngô. Yabuta (1934-1938) tách đƣợc 2 chất dƣới dạng tinh thể từ nấm lúa von gọi là gibberellin A và B, nhƣng chƣa xác định đƣợc bản chất hoá học của chúng. Năm 1955, hai nhóm nghiên cứu Anh và Mỹ phát hiện ra axit gibbellic ở cây lúa von và xác định công thức hoá học của nó (C19H22O6). Năm 1956, West, Phiney, Radley tách đƣợc gibberellin từ thực vât bậc cao và phát hiện trên 50 gibberellin và kí hiệu A1, A2, … A52 hoặc GA1, GA2, …GA52, trong đó A3 có hoạt tính mạnh nhất. Các gibberellin khác nhau chủ yếu ở vị trí nhóm –OH trong phân tử. GA đƣợc tổng hợp ở trong phôi đang sinh trƣởng, trong các cơ quan đang sinh trƣởng khác nhau nhƣ lá non, rễ non, quả non.
Vai trò sinh lý: Kích thích mạnh mẽ sự sinh trƣởng kéo dài của thân, sự vƣơn dài của lóng cây họ lúa, ảnh hƣởng lên sự sinh trƣởng các đột biến lùn. Sử dụng GA ngoại sinh để cây phát triển bình thƣờng. Kích thích sự nẩy mầm của hạt và củ. Kích thích sự ra hoa, ảnh hƣởng đặc trƣng lên sự ra hoa là sự sinh trƣởng kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa. Ảnh hƣởng sự phân hoá giới tính: ức chế sự phát triển hoa cái và kích thích sự phát triển hoa đực. Làm tăng kích thƣớc của quả, tạo quả không hạt.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng đƣợc dùng để thí nghiệm là cây tiêu giống Vĩnh Linh in vitro có sẵn trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại Học