2.1. Đa dạng của tác nhân gây bệnh
Các cá thể của loài tác nhân gây bệnh tại 1 vùng địa lý thường không đồng nhất. Chúng có thể tồn tại dưới dạng các chủng (race, strain), type sinh học (biotype), nòi sinh học (biovar, pathovar = pv.), dạng chuyên hóa (forma specialis = f.sp.)... Cần chú ý là các khái niệm race, strain....nêu trên là các khái niệm phân loại không chính thức ở mức dưới loài và thường rất khác nhau cũng như không tương đương nhau giữa các nhóm/loài tác nhân gây bệnh (thường do các nhà khoa học nghiên cứu một nhóm/loài tác nhân nào đó qui định). Ngoài ra, dựa vào các nghiên cứu phả hệ (phylogenetic), thường là các nghiên cứu phân tử, quần thể của tác nhân gây bệnh còn có thể được xếp vào các nhóm phả hệ khác nhau (phylogenetic group).
Các nhóm đa dạng trên có thể rất khác nhau về tính gây bệnh/tính độc trên một loài/giống cây ký chủ tương ứng. Do vậy, để tạo ra một giống cây kháng bệnh áp dụng cho một vùng nào đó, đầu tiên, người ta cần phải biết được mức độ đa dạng của tác nhân gây bệnh.
Một số ví dụ về mức độ đa dạng:
1. Nấm Pyricularia oryzae (bệnh đạo ôn lúa): xem chương 6
3. Nấm Fusarium oxysporum. Đây là loài nấm đa dạng, gây bệnh héo mạch dẫn trên rất nhiều loài thực vật có hoa. Loài này gồm khoảng 100 dạng chuyên hóa (formae speciales = số nhiều) căn cứ trên tính gây bệnh trên các loài cây trồng khác nhau. Mỗi dạng chuyên hóa lại có thể bao gồm các chủng khác nhau dựa trên tính gây bệnh trên giống khác nhau.
Ví dụ: Fusarium oxysporum f.sp. cubense gây hại trên các cây thuộc 2 họ Musaceae và Heliconeaceae (bộ Zingiberales). Dạng chuyên hóa này, căn cứ tính gây bệnh trên các giống chuối lại được chia thành 4 race là race 1, race 2, race 3 và race 4. Trong 4 race này, race 4 nhiễm chủ yếu trên các giống Cavendish (AAA) = nhóm chuối tiêu, và lại được chia tiếp thành race 4 nhiệt đới (tropical race 4) và race 4 cận nhiệt đới (subtropical race 4).
2.2. Các kỹ thuật dùng để nghiên cứu mức độ đa dạng của tác nhân gây bệnh là:
2.2.1.Sử dụng giống chỉ thị (khái niệm và ví dụ: xem chương ...)
2.2.2.Các phân tích phân tử
Nhiều kỹ thuật phân tử có thể sử dụng để đánh giá mức độ đa dạng của tác nhân gây bệnh. Nguyên lý và ứng dụng của các kỹ thuật này có thể tham khảo ở nhiều tài liệu tiếng Việt, tiếng Anh và internet. Dưới đây là tóm tắt một số kỹ thuật phổ biến trong nghiên cứu đa dạng tác nhân gây bệnh cây.
RAPD (random amplified polymorphic DNA). Kỹ thuật này dựa trên phản ứng PCR sử
dụng các mồi ngẫu nhiên. Các mồi ngẫu nhiên có kích thước khoảng khoảng 10 nts do đó phản ứng PCR với các mồi này nhìn chung có Ta thấp (khoảng 34-37 OC). Ưu diểm của kỹ thuật là đơn giản, không đòi hỏi biết trước thông tin về trình tự gien của tác nhân gây bệnh và có thể đánh giá mức độ đa hình trên toàn bộ bộ genome. Mức độ đa hình hình thành do sai khác tại vị trí gắn mồi và cả sai khác về độ dài (mất đoạn, thêm đoạn) giữa 2 vị trí gắn mồi. Nhược điểm lớn nhất là điều kiện PCR thường khác nhau giữa các phòng thí nghiệm dẫn tới kết quả không thống nhất.
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms). Kỹ thuật này gồm các bước chính
sau.
• Tinh chiết DNA của tác nhân gây bệnh. Vì bước tiếp theo là cắt bằng enzyme cắt giới hạn (RE = restriction enzyme) nên chất lượng DNA yêu cầu phải thật thuần khiết. • Cắt DNA bằng RE.
• Lai hóa (Southern blot) các sản phẩm cắt với dò (probe) đặc hiệu. Việc chọn lựa dò rất quan trọng đảm bảo sao cho các băng đa hình (polymorphism) hình thành đủ để phân biệt các mẫu.
• Phân tích mức độ đa hình bằng phần mềm thích hợp.
Ví dụ: Adhikari et al (1995): 308 mẫu Xoo thu thập từ nhiều nước châu Á đã được đánh
giá mức độ đa dạng bằng kỹ thuật RFLP. DNA vi khuẩn sau khi tinh chiết được cắt với EcoRI hoặc BamHI. Hai loại dò được sử dụng là (i) đoạn chứa nguyên tố lặp (repetitive element) và (ii) đoạn chứa gen AvrXa10. Kết quả phân tích cho thấy các mẫu Xoo châu Á gồm 5 cụm, vừa phân bố độc lập theo quốc gia, vừa có sự di chuyển giữa các nước.
AFLP (Amplified Restriction Fragment Polymorphism). Đây là kỹ thuật kết hợp ưu
điểm của RFLP và PCR. Sức mạnh của AFLP là khả năng kiểm tra mức độ đa hình trên toàn bộ bộ genome của tác nhân gây bệnh. Kỹ thuật gồm các bước chính sau:
• Tinh chiết DNA của tác nhân gây bệnh. Vì bước tiếp theo là cắt bằng enzyme cắt giới hạn nên, giống như đối với kỹ thuật RFLP, chất lượng DNA là yêu cầu quan trong. • Cắt DNA bằng 2 RE, thường 1 ER có chuỗi cắt hiếm (như EcoRI) còn ER kia có chuỗi
• Nối sản phẩm cắt với adaptor (chứa chuỗi ER). Sản phẩm nối là khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo. Trình tự adapter và trình tự của RE là trình tự găn mồi của bước tiếp theo.
• PCR lần 1 (preselective amplification): sử dụng 2 mồi tiền chọn lọc. Trình tự mồi tiền chọn lọc là trình tự adapter + trình tự của RE + 1 nucleotid được thêm vào đầu 3’. Sản phẩm PCR lần 1 (hòa loãng) được sử dụng làm khuôn cho PCR lần 2. Chú ý: đối với một số protocol, mồi tiền chọn lọc có thể không chứa 1 nucleotid bổ sung.
• PCR lần 2 (selective amplification): sử dụng 2 mồi chọn lọc. Trình tự mồi chọn lọc là trình tự mồi tiền chọn lọc + 2 nucleotid được thêm vào đầu 3’. Số lượng nucleotid (1,2,3) thêm vào đầu 3’ sẽ tăng mức độ chọn lọc đồng thời giảm số sản phẩm PCR tương ứng từ 4, 16 và 64 lần). Một trong 2 mồi chọn lọc thường được đánh dấu bức xạ hoặc huỳnh quang nhằm phân tích điện di tự động. Nhiều cặp mồi chọn lọc có thể được được sử dụng để đánh giá chính xác mức độ đa hình.
• Sản phẩm PCR là các băng chung + các băng khác nhau giữa các mẫu. Các băng khác nhau này là các DNA đa hình hình và sẽ được đánh giá dùng phần mềm thích hợp.
Ví dụ. Nguyễn Thị Ninh Thuận (2006): 114 mẫu P. oryzae thu thập tại miền Bắc đã được phân tích dùng kỹ thuật AFLP. RE sử dụng là EcoRI và MseI. Mồi tiền sử dụng là EcoRI primer (5’- GACTGCGTACCAATTC-3’, không chứa 1 nt bổ sung) và MSEI primer (5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’, cũng không chứa 1 nt bổ sung). Tác giả sử dụng 8 cặp mồi chọn lọc để tạo ra 733 sản phẩm AFLP-PCR trong đó 160 sản phẩm là đa hình (xem thêm chương 6).
Sequencing. Kỹ thuật giải trình tự hiện nay có thể được thực hiện dễ dàng tại nhiều
phòng thí nghiệm. Nghiên cứu phả hệ dựa vào chuỗi nucleotid hay aa thường phản ánh khá chính xác mối quan hệ cũng như mức độ đa dạng của quần thể tác nhân gây bệnh nếu chọn được vùng gen thích hợp. Hiện nay nhiều loại vector dòng hóa thuộc nhóm vector TA sẵn có trên thị trường tạo điều kiện cho việc dòng hóa nhanh chóng sản phẩm PCR mà không cần phải xử lý enzym RE. Sản phẩm PCR cũng có thể được giải mã trực tiếp không cần dòng hóa.
Ví dụ. Đối với các potyvirus (chi Potyvirus, họ Potyviridae), gen mã hóa vỏ protein (CP = Coat Protein) là gen thường được sử dụng nhiều nhất cho mục đích phân loại và nghiên cứu đa dạng. Các nghiên cứu gần đây dựa vào trình tự gen CP của một số potyvirrus thu thập tại Việt Nam cho thấy Papaya ring spot virus (PRSV) gây bệnh đốm hình nhẫn đu đủ của Việt Nam (1) rất đa dạng, (2) chia thành cụm miền Nam và miền Băc, (3) một số mẫu chia xẻ mức độ tương đồng cao với các chuỗi có nguồn gốc nước ngoài như Philippin, Nhật Bản, Đài Loan. Tương tự, trong số 13 potyvirrus được phân tích, các virus Bean common mosaic virus (BCMV), Sugarcane mosaic virus và Potatovirus Y (PVY) cũng có mức độ đa dạng rất cao. Hơn nữa, một số isolate BCMV và SCMV có vị trí nằm ở gốc của cây phả hệ (được phân tích với phần lớn các chuỗi sẵn có trên GenBank) còn cho thấy dường như Việt Nam là 1 trong những trung tâm đa dạng của 2 virus này. Mức độ đa dạng cao của 4 potyvirrus kể trên dẫn tới khó khăn đáng kể khi áp dụng các biện pháp phòng chống dựa trên tính đặc hiệu trình tự (chẳng hạn RNA silencing).