Bệnh xoăn lá cà chua được ghi nhận đầu tiên trên thế giới từ cuối những năm 40 tại Israel. Bệnh đã được phát hiện tại vùng Đông Nam Á, châu Phi và châu Âu vào những năm 80. Bệnh lần đầu tiên được công bố tại châu Mỹ vào năm 1993. Hiện nay, bệnh xoăn vàng lá đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp thế giới.
3.1. Triệu chứng bệnh
Bệnh xoăn vàng lá xuất hiện triệu chứng trong vòng 2-4 tuần sau khi nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ triệu chứng trong vòng 2 tháng. Triệu chứng có thể thay đổi theo điều kiện môi trường, giai đoạn sinh trưởng và điều kiện sinh lý của cây tại thời điểm nhiễm bệnh.
Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về sau, lá không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá cuốn cong lên phía trên
thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây
lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn. Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng
Triệu chứng do các loài begomovirus khác nhau gây ra trên cà chua thường tương tự nhau.
3.2. Nguyên nhân gây bệnh
3.2.1.Tác nhân gây bệnh là một phức hợp loài
Trước những năm 90, tác nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua đã được xác định do các begomovirus (chi Begomovius, họ Geminiviridae) truyền qua bọ phấn (Bemisia tabaci) gây ra. Các begomovirus gây bệnh thường được đặt tên theo cây ký chủ (tomato) và triệu chứng (chủ yếu dưới 2 dạng xoăn lá (leaf curl) và biến vàng (yellow)) nên tên virus gây bệnh thường là “Tomato yellow leaf curl virus” và tên các isolate virus gây bệnh thường được kèm theo 1 từ chỉ địa phương nơi bệnh xuất hiện; ví dụ Tomato yellow leaf curl - Is (TYLCV-Is) phân lập từ Israel, Tomato yellow leaf curl – Th (TYLCV-Th) phân lập từ Thái Lan... Do có ít lựa chọn trong việc đặt tên, các tác giả cũng có xu hướng lấy chỉ triệu chứng xoăn lá “leaf curl” để đặt tên virus; chẳng hạn Tomato leaf curl virus-Au (ToLCV-Au) phân lập từ Úc. Tomato leaf curl Guzarat virus (ToLCGV)... mặc dù các virus này đều tạo triệu chứng biến vàng trên cà chua.
Từ những năm 90 trở lại đây, sự tiến bộ của công nghệ sinh học đã cho phép giải trình tự toàn bộ bộ gen virus một cách dễ dàng. Dựa vào các phân tích phân tử, Ủy ban Phân loại Virus Quốc tế (International Committee on Taxonomy of Viruses -ICTV) đã xác định ngưỡng phân biệt loài begomovirus là 89 % tương đồng chuỗi nucleotide cho DNA-A. Chỉ
tiêu này đã cho phép tách được nhiều begomovirus, vốn được xem là các isolate khác nhau của cùng một loài gây bệnh xoăn vàng lá cà chua, thành các loài phân biệt; ví dụ TYLCV-Ch trở thành loài Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV), TYLCV-Th trở thành loài
Tomato yellow leaf curl Thailand virus (TYLCSV)...và isolate TYLCV-Is phân lập từ
Israel, do quyền ưu tiên, được công nhận là loài Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV).
Tương tự, Tomato leaf curl virus – Taiwan (ToLCV-TW) trở thành loài Tomato leaf curl
Taiwan virus (ToLCTWV)...và isolate ToLCV-Au phân lập đầu tiên từ Úc, do quyền ưu
tiên, được công nhận là Tomato leaf curl virus (ToLCV)
Như vậy, tác nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua được xem là một phức hợp các loài khác nhau. Hiện có khoảng 40 loài begomovirus hại cà chua đã được công bố trên thế giới với triệu chứng không thể phân biệt được. Hậu quả là, dựa trên triệu chứng quan sát, bệnh không thể được gán cho một loài begomovirus cụ thể trừ phi danh tính của virus đã được xác định. 3.2.2.Hình thái của begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua
Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua nói riêng và begomovirrus nói chung thuộc chi Begomovirus (họ Geminivirus). Các geminivirus đều có cấu trúc phân tử (virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron) nối với nhau để tạo ra phân tử hình cầu đa diện kép (gemini).
3.2.3.Đặc điểm bộ gien của begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua
Các begomovirus là các virus thực vật có bộ gien DNA vòng đơn có kích thước khoảng 2.6 – 2.8 kb. Chúng hoặc có bộ gien kép gồm 2 phân tử DNA sợi vòng đơn gọi là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gien đơn tương đương DNA-A
Đối với các virus có bộ gien đơn thì DNA-A của chúng chứa 6 gien được tổ chức theo 2 chiều ngược nhau.
Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có 2 gien là (i) V1 mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo vỏ phân tử virus, lan truyên qua vector, vận chuyển bộ gien virus vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gien virus giữa các tế bào; và (ii) V2 mã hóa protein V2 có chức năng liên quan đến vận chuyển virus giữa các tế bào.
Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) có 4 gien là (i) C1 mã hóa protein tái sinh hay còn gọi là protein Rep có chức năng chính là cắt - nối bộ gien virus tại một vị trí đặc biệt ở vùng nguồn gốc tái sinh và tương tác với protein ký chủ để tạo điều kiện thuận lợi cho tái sinh virus, (ii) C2 mã hóa 1 protein hoạt hóa phiên mã, (iii) C3 mã hóa 1 protein tăng cường tái sinh và (iv) C4 mã hóa protein C4 với chức năng liên quan đén phổ ký chủ và phát triển triệu chứng.
Giữa 2 vùng gen mã hóa ngược chiều nhau ở trên là một vùng không mã hóa chứa nguồn gốc tái sinh (ori = origin of replication) gồm (i) các chuỗi lặp đảo (iteron) cần thiết cho sự nhận biết và gắn kết của protein Rep và (ii) một cấu trúc thân – thòng lọng trong đó chuỗi TAATACTAT trên vùng thòng lọng là giống nhau ở tất cả các begomovirus và vị trí TA cuối cùng là nơi protein Rep cắt và nối bộ gien begomovirrus trong quá trình tái sinh.
Đối với các begomovirus có bộ gien kép thì DNA-A có tổ chức bộ gienome và chức năng các gien tương tự như DNA-A của các begomovirus có bộ gien đơn (tên các gien được thêm ký tự A vào đằng trước thành AV1, AV2, AC1, AC2, AC3 và AC4); còn DNA-B của chúng chỉ chứa 2 gien được sắp xếp theo 2 chiều ngược nhau và mã hóa 2 protein là (i) protein con thoi có chức năng vận chuyển bộ gien virus vào và ra khỏi nhân tế bào và (ii) protein vận chuyển có chức năng vận chuyển bộ gien virus giữa các tế bào ký chủ.
3.3. Xâm nhiễm gây bệnh
3.3.1.Lan truyền của begomovirus
Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B. tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn. Chưa có bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ phấn.
Bọ phấn dùng vòi cho vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch phloem. Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới tuyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt. Nghiên cứu với TYLCV cho thấy thời gian chích nạp và chích truyền tối thiểu của bọ phấn là khoảng 15 – 20 phút. Kể từ khi bắt đầu chích nạp, virus được phát hiện có mặt ở phần đầu sau khoảng 10 phút, ở ruột giữa.sau khoảng 50 phút, ở xoang cơ thể sau khoảng 90 phút và ở tuyến nước bọt sau khoảng 7 giờ. Thời gian từ khi virus được phát hiện thấy ở tuyến nước bọt tới khi bọ phấn có thể truyền được bênh là khoảng 1 giờ. Như vậy thời kỳ ẩn của TYLCV trong cơ thể bọ phấn là khoảng 8 giờ.
3.3.2.Tái sinh (sinh sản) của begomovirus
Begomovirus, giống như các geminivirus khác, tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism). Cơ chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào ký chủ.
Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gien có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng kép khi bộ gien virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi virus và một sợi tương đồng virus. Pha này vẫn chưa được hiểu rõ.
Pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại chuỗi bảo toàn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tế bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep lại tiếp tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới được tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gien virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh.
3.4. Tính kháng đối với begomovirus
3.4.1.Tính kháng của begomovirus thông qua gen kháng
Cho tới nay, người ta chưa phát hiện thấy gen kháng R chống lại begomovirus trên cây cà chua trồng (Lycopersicon esculentum). Tuy nhiên một số gen kháng chống lại begomovirus đã được phát hiện thấy trên một số giống cà chua dại. Ví dụ Ty1 gen được phân lập từ cây cà chua dại (Lycopersicon chilense) và là một gen kháng trội không hoàn toàn. Ty-1 dường như tương tác với các protein chịu trách nhiệm di chuyển của virus để tạo tính kháng. Ty-1 đã được chuyển vào cà chua trồng để tạo giống kháng.
3.4.2.RNA silencing và begomovirus
RNA silencing là cơ chế quan trọng của cây (cũng như của nấm, động vật) nhằm điều hòa biểu hiện gen và chống sự xâm nhiễm virus. Cây có một số đường hướng silencing, trong đó quan trọng nhất là đường hướng RNA silencing thông qua siRNA. Đây là đường hướng xảy ra ở tế bào chất và trong trường hợp chống sự xâm nhiễm virus sẽ gồm các bước chính sau: 1. Hình thành các dsRNA trong tế bào chất. Các virus RNA thực vật trong quá trình tái sinh
sẽ hình thành các sản phẩm trung gian là dsRNA. Các begomovirus, do các gen mã hóa theo 2 chiều ngược nhau dẫn sản phẩm phiên mã của chúng (các transcripts) sẽ gối lên
nhau và tương đồng ở đầu 3’. Phần tương đồng gối lên nhau này sẽ bắt cặp để tạo đoạn dsRNA.
2. Các protein Dicer (là một endonuclease thuộc RNAse nhóm 3, chịu trách nhiệm cắt các phân tử RNA sợi kép) của tế bào ký chủ sẽ cắt đoạn dsRNA thành các phân tử dsRNA nhỏ có kích thước 21-22 nts gọi là các siRNA.
3. Các phân tử siRNA sợi kép tách thành các phân tử siRNA sợi đơn và kết hợp với các phân tử protein của tế bào tạo thành phức hợp RISC (RNA Induced Silencing Complex), trong đó chứa một RNA endonuclease là Argonaute (ký hiệu là AGO).
4. RISC sẽ nhận biết được các phân tử RNA virus trong tế bào chất và tương đồng với siRNA. Đoạn siRNA sợi đơn sẽ bắt cặp đặc hiệu với phần tương đồng trên phân tử RNA virus và AGO của RISC sẽ cắt phân tử RNA virus.
RNA silencing là một cơ chế của cây chống lại virus thì virus cũng có cơ chế để chống lại sự silencing của cây. Người ta đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng C4 (hay AC4) của begomovirrus có thể ức chế đường hướng RNA silencing của cây ký chủ trong tế bào chất.
3.5. Bệnh xoăn lá cà chua ở Việt Nam.
Trong số bệnh virus hại cà chua ở Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh quan trọng nhất. Hiện nay tỉ lệ nhiễm bệnh xoăn lá trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có khi tới 100 %.
Ở Việt Nam, đã có 3 loài begomovirus được phát hiện gây ra bệnh xoăn lá cà chua. Loài thứ nhất là Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV), được phân lập từ cây cà chua bị bệnh xoăn lá ở miền Bắc vào năm 2001.
Loài thứ hai là Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi (TYLCKaV), được phân lập đầu tiên ở tỉnh Kanchanaburi (Thái Lan) vào năm 2002 và được phát hiện thấy trên cây cà chua tại Việt Nam vào năm 2005.
Gần đây, từ một mẫu cà chua bị bệnh xoăn lá thu thập tại Hà Nội, cùng với ToLCVV, một loài begomovirus thứ ba cũng đã được phân lập. Các phân tích phân tử đã cho thấy loài thứ ba này là một loài mới và được đặt tên là Tomato yellow leaf curl Vietnam virus
(TYLCVNV). TYLCVNV và ToLCVV chia sẻ một vùng khoảng 1000 nts gần như đồng nhất ở bên trái của bộ gen.
CHƯƠNG 8. CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG
1. Giới thiệu
Các nhà chọn giống và sản xuất đã nhận ra giá trị của tính kháng bệnh đối với cây trồng từ đầu thế kỷ 19. Ngày nay, việc chọn tạo giống kháng dịch hại đã trở nên cực kỳ quan trọng
do mức độ thâm canh ngày càng tăng và con người đã hiểu rõ các ảnh hưởng bất lợi đối với môi trường và sức khỏe của việc sử dụng biện pháp hóa học.
Các kỹ thuật công nghệ sinh học đã giúp các nhà chọn giống kháng hiểu rõ cơ chế tương tác giữa cây và tác nhân gây bệnh, sự đa dạng của quần thể tác nhân gây bệnh cũng như bản chất các gen kháng bệnh của cây. Các kiến thức này là cơ sở khoa học cho các chương trình chọn tạo giống kháng.
Giống kháng bệnh luôn là một thành phần quan trọng của bất kỳ chiến lược phòng chống dịch nào; và một khi sẵn có, sử dụng giống kháng là biện pháp phòng chống hiệu quả nhất, rẻ tiền nhất đối với nông dân.
Các bước chính đối với một chương trình chọn tạo giống kháng bao gồm 1. Xác định mức độ đa dạng của quần thể tác nhân gây bệnh
2. Xác định nguồn gen kháng 3. Lựa chọn gen kháng phù hợp 4. Chuyển gen vào giống cây ưu tú
5. Chọn lọc và đánh giá dòng/giống cây ưu tú mang gen kháng 6. Đánh giá trên qui mô đồng ruộng
7. Đăng ký và ứng dụng
Các bước trên, về cơ bản cũng tương tự như các bước chọn tạo giống mang các tính trạng nông học. Các kỹ thuật lai và chuyển gien có thể tham khảo ở nhiều giáo trình chọn giống và công nghệ sinh học. Dưới đây chỉ trình bày một số chủ đề hoặc chú ý liên quan đến chọn tạo giống kháng bệnh.