3. Địa điểm, đối t−ợng, nguyên liệu, nội dung
3.5.Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.5.1. Chỉ tiêu lâm sàng
- Đo thân nhiệt: bằng nhiệt kế vào buổi sáng (6-8 giờ) qua trực tràng, tr−ớc khi lấy mẫu máu và mẫu sữa.
- Đo tần số hô hấp: dùng ống nghe đặt vào thành ngực bên phải hoặc bên trái rồi tính tần số hô hấp/1phút. Có thể đếm động tác thở qua quan sát thành bụng hoặc nhịp thở qua cánh mũi/1phút.
- Đếm tần số tim mạch: áp ống nghe vào vùng ngực trái (đằng tr−ớc, phía d−ới) đếm nhịp tim/1phút.
3.5.2. Chỉ tiêu sinh lí, sinh hoá máu
3.5.2.1. Ph−ơng pháp lấy mẫu
- Lấy mẫu máu: thời gian lấy mẫu máu vào buổi sáng (6-8 giờ) tr−ớc khi cho bò ăn và vắt sữa. Lấy máu ở tĩnh mạch cổ hoặc tĩnh mạnh rìa tai, dùng
cồn 700 sát trùng vùng tĩnh mạch mà ta tiến hành lấy máu, tuỳ vào mục đích
nghiên cứu mà có các ph−ơng pháp lấy máu khác nhau. Dùng kim số 16, kim phải đ−ợc sát trùng và để khô. Nếu cần lấy huyết thanh thì cho máu chảy vào ống nghiệm, nhẹ nhàng theo thành ống, rồi nghiêng ống cho máu đông lại, chắt lấy phần huyết thanh ở trên. Nếu lấy huyết t−ơng hay để đếm số l−ợng huyết cầu thì dùng chất chống đông nh− Natrixitrat 0,002g cho 1ml máu. Dùng lọ penicillin rửa thật sạch, sấy khô để lấy mẫu.
- Lấy mẫu sữa: tr−ớc khi tiến hành lấy mẫu sữa ta cần vệ sinh tắm rửa bò sữa, bầu vú lấy mẫu và khu vực xung quanh. Dùng khăn khô lau bầu vú sau
đó dùng bông hay gạc vô trùng đk tẩm cồn ethanol 700 lau lại bầu vú, núm vú.
Mẫu sữa sẽ đ−ợc lấy vào ống nghiệm hay lọ vô trùng có nắp đậy. Cần đánh số thứ tự các núm vú và quy định nh− sau:
1. Vú trái tr−ớc 3. Vú phải tr−ớc
2. Vú trái sau 4. Vú phải sau
Bỏ đi vài tia sữa đầu rồi lấy mỗi núm vú 15-20ml sữa. Mẫu sữa đ−ợc lấy
cần ghi rõ ngày lấy mẫu, số hiệu bò và bảo quản lạnh ở nhiệt độ 4-50C. Tuỳ
theo mục đích của từng thí nghiệm mà bố trí các loại dụng cụ đựng cho phù hợp, mẫu phải đ−ợc phân tích tr−ớc 12 giờ kể từ khi lấy.
3.5.2.2. Các chỉ tiêu sinh lí máu
- Đếm số l−ợng hồng cầu (triệu/mm3): dùng bằng máy huyết học 18 chỉ
tiêu (Hema - Screen 18).
- Đếm số l−ợng bạch cầu (nghìn/mm3): dùng bằng máy huyết học 18
- Công thức bạch cầu (%): công thức bạch cầu là tỉ lệ % của 5 loại bạch cầu: trung tính, ái toan, ái kiềm, đơn nhân lớn và lâm ba cầu. Phân loại bạch cầu bằng máy huyết học 18 chỉ tiêu.
- Hemoglobin (g%): tiến hành xác định bằng máy huyết học 18 chỉ tiêu (Hema - Screen 18)
- Tỉ khối huyết cầu: là tỉ lệ % của khối huyết cầu chiếm trong một thể tích máu nhất định. Dùng ph−ơng pháp của Wintrobe 1933, Bunee 1954 và máy huyết học 18 chỉ tiêu.
- Sức kháng hồng cầu là sức kháng của màng hồng cầu ở các nồng độ muối khác nhau. Nh−ng sức đề kháng đó chỉ có hạn, nếu dung dịch quá quá nh−ợc tr−ơng thì hồng cầu sẽ bị vỡ gọi là dung huyết. Ng−ợc lại cho hồng cầu vào dung dịch −u tr−ơng thì nó sẽ bị teo lại. Cho vào các ống nghiệm dung dịch NaCl 1% và n−ớc cất với l−ợng khác nhau để đ−ợc nồng độ nh− bảng 3.1:
Bảng 3.1. Nồng độ dung dịch NaCl (%) ố ố ố ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NaCl 1%(ml) 1,40 1,36 1,32 1,28 1,24 1,20 1,16 1,12 1,08 1,04 N−ớc cất (ml) 0,60 0,64 0,68 0,72 0,76 0,80 0,84 0,88 0,92 0,96 Nồng độ (%) 0,70 0,68 0,66 0,64 0,62 0,60 0,58 0,56 0,54 0,52 ố ố ố ống nghiệm 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 NaCl 1%(ml) 1,0 0,96 0,92 0,88 0,84 0,80 0,76 0,72 0,68 0,64 N−ớc cất (ml) 1,00 1,04 1,08 1,12 1,16 1,20 1,24 1,28 1,32 1,36 Nồng độ (%) 0,50 0,48 0,46 0,44 0,42 0,40 0,38 0,36 0,34 0,32
Dùng ống hút cho vào mỗi ống nghiệm 0,1ml máu (2 giọt). Trộn đều nhẹ nhàng, để yên trong 2 giờ rồi đọc kết quả: sức kháng tối thiểu tính từ ống bắt đầu có hiện t−ợng dung huyết, sức kháng tối đa tính từ ống có sự dung huyết hoàn toàn.
3.5.2.3. Các chỉ tiêu sinh hoá máu
- Đo độ dự trữ kiềm (mg%): định l−ợng theo ph−ơng pháp Nevodop. - Định l−ợng protein tổng số trong huyết thanh (g%): bằng máy phân tích các chỉ tiêu sinh hoá tự động.
- Xác định các tiểu phần protein trong huyết thanh: bằng kỹ thuật điện di huyết thanh trên phiến Axetat cellolose.
- Định l−ợng đ−ờng huyết (mmol/l): tiến hành đo hàm l−ợng đ−ờng bằng máy Glucometre. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.5.2.4. Một số chỉ tiêu chất l−ợng sữa
- Phân tích thành phần hoá học trong sữa bằng máy Lactostar.
- Đo độ axit chung của sữa: độ axit chung của sữa là số ml NaOH 0,1N dùng để trung hoà hết l−ợng axit tự do có trong 100ml sữa. Độ axit chung
đ−ợc tính bằng độ Terner (0T).
- Ph−ơng pháp đếm tế bào trong sữa của Hopkirrk. Trong quá trình viêm một số l−ợng lớn tế bào nhũ nang của tuyến vú rơi vào trong sữa, đồng thời bạch cầu cũng xuất hiện để làm nhiệm vụ thực bào, các tế bào này tăng lên rất nhiều khi tuyến vú bị viêm, do đó có thể sử dụng ph−ơng pháp đếm tế bào trong sữa để xác định mức độ viêm.
Lấy 10ml sữa li tâm trong 5 phút, lấy cặn nhuộm tiêu bản bằng ph−ơng pháp nhuộm Giemsa, đếm trên kính hiển vi với vật kính dầu 100.
Công thức tính: X = (X1 + X2 + X3 + ... + X10)/10 Cách đánh giá kết quả bảng 3.2:
Bảng 3.2. Đánh giá kết quả đếm tế bào trong sữa Số l−ợng tế bào Mức đánh giá Phản ứng 1 vi tr−ờng Trong 1ml sữa 0 Âm tính (-) 0 - 0,4 < 400.000 1 Âm tính (-) 0,5 400.000 - 500.000 2 Nghi ngờ (±) 0,6 -1,5 500.000 - 1.200.000 3 D−ơng tính (+) 1,6 - 5,0 1.250.000 - 4.000.000 4 D−ơng tính (++) 6,0 - 15,0 4.200.000 - 12.000.000 5 D−ơng tính (+++) 16,0 - 40,0 12.500.000 - 32.000.000 6 D−ơng tính (++++) > 40,0 > 32.000.000
- Ph−ơng pháp kiểm tra vi sinh vật: chẩn đoán qua nuôi cấy, phân lập vi khuẩn gây bệnh. Ph−ơng pháp này cho phép biết chính xác vi khuẩn gây viêm vú thuộc loại nào.
Mẫu sữa viêm pha lokng với độ pha lokng từ 10-6, 10-7, 10-8, mỗi độ pha
lokng đ−ợc cấy vào 2 đĩa thạch th−ờng, đem bồi d−ỡng ở tủ ấm 370C sau 18
đến 24 giờ đọc kết quả.
Xác định số vi khuẩn thông qua việc phân loại vi khuẩn bằng hình thái, kích th−ớc màu sắc và dạng khuẩn lạc (S, R,M). Lấy những khuẩn lạc t−ơng tự những khuẩn lạc đk xác định, đem cấy vào môi tr−ờng đặc tr−ng để phân lập khuẩn lạc thuần khiết. Để phân loại những vi khuẩn chính gây bệnh viêm vú
bò nh− Staphylococcus, Streptococcus, E.coli chúng tôi sử dụng các môi
tr−ờng môi tr−ờng n−ớc thịt, môi tr−ờng thạch th−ờng, môi tr−ờng thạch
Chapman, môi tr−ờng Macconkey, môi tr−ờng EMB (Eosin methyl blue), môi tr−ờng Endo.
- Xác định mức độ ảnh h−ởng của bệnh viêm vú bò sữa đến sản l−ợng sữa hàng ngày. Tiến hành điều tra và theo dõi sản l−ợng sữa hàng ngày của bò tr−ớc khi bị viêm vú và sản l−ợng sữa hàng ngày khi bò bi bệnh viêm vú.
- Ph−ơng pháp dùng thuốc thử CMT (California Mastitis Test): đây là cách tốt nhất để phát hiện ra l−ợng tế bào thân trong sữa. Những phản ứng CMT liên quan nhiều đến số l−ợng tế bào thân. Các phản ứng d−ơng tính đánh giá mức độ viêm vú ở bò. L−ợng tế bào thân có xu h−ớng tăng trong thời gian tiết sữa và vẫn giữ số l−ợng cao trong vài giờ sau đó, kể cả những núm vú không bị bệnh. Vậy, ta chỉ nên thực hiện các test tr−ớc khi vắt sữa (ngay sau khi kích thích bò tiết sữa bằng cách loại bỏ sữa đầu). CMT phản ứng với chất có mặt trong tế bào trong tế bào thân ở sữa nhờ các gel. Sự tập chung tế bào thân cao trong sữa (>200.000 TB/ml) là dấu hiệu không bình th−ờng của bầu vú.
Bảng 3.3. Đánh giá kết quả CMT (California Mastitis Test)
Mức đánh giá Phản ứng Số l−ợng tế bào/ml
sữa
Hỗn hợp không có biến đổi gì Âm tính (-) 0 - 200.000
Hỗn hợp có vẩn rất nhỏ li ti để một lúc thì tan ra Nghi ngờ (±) 150.000-500.000
Hỗn hợp có vẩn đục nh−ng không nhớt D−ơng tính (+) 400.000-1.500.000
Nhanh chóng hình thành cục nhớt dính từ vùng
trung tâm hỗn hợp D−ơng tính (++) 800.000-5.000.000
Hỗn hợp kết dính t−ơng đối chắc, khi nghiêng
không bị rớt xuống D−ơng tính (+++) ≥ 5.000.000
Hình thành khối kết dính, lật úp phiến kính hỗn hợp
Một số loại máy sử dụng trong nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ảnh 3.1. Máy Glucometre