3. VẬT LIỆU, ðỊ Að IỂM, NỘI DUNG
3.4.Phương phỏp nghiờn cứu
3.4.1. Phương phỏp nghiờn cứu ngoài ủồng ruộng
* Phương phỏp ủiều tra ngoài ủồng ruộng [39]
ðiều tra tỡnh hỡnh bệnh ủạo ụn
- Ruộng ủiều tra: trờn mỗi giống, mỗi ủợt gieo cấy khỏc nhau, mỗi loại chõn ủất khỏc nhau, cỏnh ủồng khỏc nhau chọn 3 ruộng ủại diện ủểủiều tra.
- ðiểm ủiều tra: Mỗi ruộng ủiều tra theo 5 ủiểm chộo gúc, mỗi ủiểm ủiều tra 10 khúm, mỗi khúm 1 dảnh, cõy ủiều tra ủầu tiờn cỏch bờ ớt nhất 2 m.
- Chỉ tiờu ủiều tra: ðiều tra số lỏ, bụng bị bệnh và phõn cấp lỏ, bụng bị
bệnh ủể tớnh chỉ số và tỉ lệ bệnh. - Thời gian ủiều tra:
Giai ủoạn lỳa ủẻ nhỏnh, ủứng cỏi, làm ủũng và trước khi trỗ
+ Bệnh ủạo ụn cổ bụng: Tiến hành ủiều tra vào cỏc giai ủoạn chớn sỏp (khoảng sau trỗ 20 - 25 ngày).
ðiều tra diễn biến bệnh trờn giống nhiễm
- ðịa ủiểm ủiều tra: Chỳng tụi tiến hành ủiều tra ở hai xó Quang Phục - Tứ
Kỳ và Hồng Phong - Ninh Giang, ủõy là vựng thuần lỳa ủiển hỡnh của tỉnh. - Trà gieo cấy: Năm 2008 do chỉ cú trà xuõn muộn, chớnh vỡ vậy chỳng tụi tiến hành ủiều tra trờn trà gieo cấy từ 20/2 ủến 29/2.
- Giống ủiều tra: Giống lỳa Q5.
- ðiểm ủiều tra: Mỗi ruộng ủiều tra 5 ủiểm chộo gúc, mỗi ủiểm ủiều tra 10 khúm, mỗi khúm 1 dảnh, cõy ủiều tra ủầu tiờn cỏch bờ ớt nhất 2 m.
- Thời gian ủiều tra: Theo quy ủịnh của ngành 7 ngày/1 lần.
- Chỉ tiờu theo dừi: Từ giai ủoạn lỳa ủẻ nhỏnh ủến giai ủoạn thấp thụ trỗ
(trỗ 5%) theo dừi bệnh trờn lỏ (ủạo ụn trờn lỏ), từ khi trỗủều ủến thu hoạch theo dừi bệnh trờn bụng (ủạo ụn cổ bụng).
* Phõn cấp bệnh ủạo ụn [39]
Phõn cấp bệnh trờn lỏ
Cấp 0: Khụng cú cấp bệnh trờn lỏ.
Cấp 1: Cỏc vết bệnh màu nõu, nhỏ như mũi kim, khụng cú vựng sinh bào tử. Cấp 2: Vết bệnh nhỏ, trũn hoặc hỡnh thoi dài, ủường kớnh 1 - 2 mm, cú viền nõu rừ rệt, hầu hết cỏc lỏ dưới ủều cú vết bệnh.
bị bệnh ở cỏc lỏ phớa dưới nhỏ hơn 4% diện tớch lỏ. Cấp 5: Vết bệnh ủiển hỡnh, cỏc vết bệnh cú thể liờn kết với nhau, diện tớch vết bệnh từ 4-10% diện tớch lỏ. Cấp 6: Diện tớch vết bệnh từ 10 - 25% diện tớch lỏ. Cấp 7: Diện tớch vết bệnh chiếm từ 26 - 50% diện tớch lỏ. Cấp 8: Diện tớch vết bệnh chiếm từ 51 - 75% diện tớch lỏ. Cấp 9: Diện tớch vết bệnh chiếm trờn 75% diện tớch lỏ. Phõn cấp bệnh trờn bụng Cấp 0: Khụng cú vết bệnh trờn bụng. Cấp 3: Vết bệnh trờn một vài giộ sơ cấp hoặc phần giữa của trục bụng. Cấp 5: Vết bệnh bao quanh một phần gốc bụng (ủốt) hoặc phần ống rạ phớa dưới của trục bụng.
Cấp 7: Vết bệnh bao quanh toàn bộ cổ bụng hoặc một phần trục bụng gần cổ bụng, trờn bụng cú 30% số hạt chắc trở lờn.
Cấp 9: Toàn bộ bụng bị bệnh, số hạt chắc trờn bụng dưới 30%.
* Khảo sỏt hiệu lực của thuốc hoỏ học ủối với bệnh ủạo ụn
Khảo sỏt hiệu lực của thuốc Lilacter 0,3SL ủối với bệnh ủạo ụn lỏ khi phun ở cỏc nồng ủộ khỏc nhau [2] - Thớ nghiệm ủược tiến hành với cỏc cụng thức: Cụng thức 1: Nồng ủộ 0,10% (0,55 lớt/ha) Cụng thức 2: Nồng ủộ 0,15% (0,83 lớt/ha) Cụng thức 3: Nồng ủộ 0,20% (1,11 lớt/ha) ðối chứng: Khụng phun thuốc
- Diện tớch ụ thớ nghiệm: Mỗi ụ thớ ngiệm cú diện tớch là 50 m2, nhắc lại 3 lần và ủược bố trớ theo khối ngẫu nhiờn hoàn chỉnh (RCB).
- Dụng cụ: Dựng bỡnh bơm tay ủeo vai phun với lượng nước thuốc là 500 lớt/ ha. - Thời ủiểm phun thuốc: Phun khi ruộng cú tỉ lệ khoảng 5%.
- Chỉ tiờu theo dừi: Số lỏ bị bệnh và phõn cấp lỏ bệnh.
- Th ời ủiểm theo dừi: Trước khi phun và sau khi phun 5, 10, 15 và 20 ngày. - Cụng thức tớnh toỏn: Hiệu lực của thuốc ủược tớnh theo cụng thức Henderson – Tilton.
So sỏnh hiệu lực của 2 loại thuốc: Lilacter 0,3SL và thuốc Fillia 525SE (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ủối với bệnh ủạo ụn lỏ [2]
- Thớ nghiệm ủược tiến hành với cỏc cụng thức sau: Cụng thức 1: Lilacter 0,3SL (0,83 lớt/ha) Cụng thức 2: Fillia 525SE (0,50 lớt/ha)
ðối chứng : Khụng phun thuốc
- Diện tớch ụ thớ nghiệm, dụng cụ, thời ủiểm phun thuốc, chỉ tiờu theo dừi, thời ủiểm theo dừi và cụng thức tớnh toỏn thực hiện tương tự như thớ nghiệm khảo sỏt hiệu lực phũng trừ của thuốc Lilacter 0,3SL với cỏc nồng ủộ khỏc nhau ở trờn. 3.4.2. Phương phỏp nghiờn cứu trong phũng
* Phương phỏp phõn lập nấm (phõn lập theo phương phỏp cấy ủơn bào tử)
- Mẫu bệnh sau khi thu thập về (ủối với mẫu ủó bảo quản khụ) ủem rửa sạch bằng nước mỏy sau ủú rửa bằng nước cất, cắt một ủoạn cả mụ khoẻ và mụ bị bệnh ủặt trong ủĩa petri cú giấy lọc ẩm, ủậy nắp, ủể ủĩa ở nhiệt ủộ 26 - 280C
- ðối với mẫu tươi, tiến hành phõn lập ngay với cỏc bước tiếp theo:
+ Lấy ủĩa WA (Water agar), cầm ỳp mặt thạch, gấp ủoạn lỏ hoặc cổ bụng cú vết bệnh theo hỡnh tam giỏc, dựng panh cặp và ủặt cho bào tử ở vết bệnh dớnh vào bề mặt thạch, dựng bỳt dạ khoanh khu vực ủặt vết bệnh ủể khi ủưa lờn kớnh hiển vi dễ quan sỏt bào tử.
+ Dựng panh lấy một ớt bụng thấm nước, nhỳng vào cồn 96% rồi khử trựng kim thuỷ tinh.
+ ðưa ủĩa WA cú bào tử lờn kớnh hiển vi, quan sỏt và nhẹ nhàng lấy bào tử
vào ủầu kim thuỷ tinh (ủiều chỉnh kớnh, kim thuỷ tinh sao cho mỗi lần khờu lấy chớnh xỏc một bào tử cấy). Vặn cho vật kớnh lờn cao, ủưa ủĩa WA ra và cho ủĩa PSA vào theo chiều ỳp mặt thạch xuống phớa dưới, dựng bỳt dạ khoanh trũn 4 khoanh ở
bốn gúc của ủĩa, rồi từ từ thả bào tử từ ủầu kim thuỷ tinh vào nơi cú ủỏnh dấu khoanh trũn trờn ủĩa PSA. Mỗi khoanh trũn một bào tử (mỗi ủĩa PSA thả 4 bào tử).
+ ðậy nắp ủĩa lại và ủặt vào tủ ủịnh ụn cú nhiệt ủộ ổn ủịnh 260C- 280C. Sau 3- 4 ngày bào tử phỏt triển thành tản nấm, dựng que cấy nấm (ủó ủược vụ trựng) lấy một mẩu thạch cú sợi nấm non cấy vào ống nghiệm cú mụi trường PSA nghiờng ủể giữ nguồn dựng nghiờn cứu.
* Phương phỏp nghiờn cứu khả năng phỏt triển của nấm Pyricularia
oryzae Cav. trờn cỏc mụi trườngnhõn tạo
Chuẩn bị mụi trường nghiờn cứu
Chuẩn bị 4 loại mụi trường: PSA, cỏm Agar, PGA và OMA. Bước 1: Chuẩn bịủĩa petri
Bước 2: Nấu mụi trường
+ Mụi trường PSA: Dựng 1kg khoai tõy ủõy ủó gọt sạch vỏ, cắt thành từng lỏt mỏng + 1 lớt nước ủun sụi 30 phỳt sau ủú dựng lớp vải màn kộp ủể lọc ta ủược nước khoai tõy (PB: Potato Broth). Lấy 200ml PB ủun sụi, cho vào ủú 20g
ủường ăn + 20g agar, ủổ thờm nước cất cho ủủ 1 lớt mụi trường.
+ Mụi trường PGA: làm tương tự như PSA nhưng thay ủường ăn (Sacaroza) bằng ủường ủơn glucoza.
+ Mụi trường OMA: Cho 50g bột mạch + 500ml nước cất khụng ion vào
trong xoong, quấy ủều. Sau ủú, ủặt lờn bếp ủun nhỏ lửa và cho thờm 20g ủường
ăn vào xoong và quấy ủều. Pha 20g agar vào trong 200ml nước cất khụng ion,
lắc ủều rồi ủổ dung dịch này vào xoong dung dịch ủang ủun nờu trờn và quấy
ủều. Cho thờm 300ml nước cất khụng ion vào xoong cho ủủ 1 lớt mụi trường. + Mụi trường cỏm agar: Cho 20g cỏm vào rong một lớt nước cất, ủun sụi trong 20 phỳt sau ủú lọc qua lớp vải màn, bỏ bó. Cho thờm vào dung dịch 5g
ủường ăn + 20g agar, bổ sung thờm nước cho ủủ 1 lớt mụi trường, Bước 3: Hấp khử trựng mụi trường
- ðổ mụi trường vào bỡnh tam giỏc (333ml/ 500ml), ủậy lại bằng giấy bạc rồi ủem hấp ở 120oC trong 20 phỳt.
Bước 4: ðổ mụi trường vào ủĩa Petri ủó vụ trựng, ủể nguội sau ủú cấy nấm.
Chuẩn bị nguồn nấm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dựng que cấy lấy nấm từ ống nguồn, cấy vào ủĩa petri mụi trường PSA (cấy một ủiểm chớnh giữa trờn ủĩa), sau 4- 6 ngày nấm mọc thành tản nấm và
- Cấy nấm: Từ nguồn nấm Pyricularia oryzae Cav. thuần ủó mọc ở trờn ủĩa PSA, dựng ủột trũn cú ủường kớnh 5 mm ủột nấm ở ủĩa nguồn theo ủường trũn
ủồng tõm. Dựng que cấy nấm lấy từng khoanh cấy trờn 4 loại mụi trường ủó chuẩn bị, mỗi ủĩa cấy một khoanh ở chớnh giữa, mỗi loại mụi trường, mỗi chủng phõn lập cấy 3 ủĩa (3 lần nhắc lại).
Cỏc chỉ tiờu theo dừi
- ðo ủường kớnh của tản nấm sau khi cấy nấm tại cỏc thời ủiểm sau cấy 2, 4, 6, 8, 10 ngày. ðo giỏn tiếp ở phớa ngoài của hộp, khụng mở nắp hộp, mỗi ủĩa
ủo 2 lần theo hỡnh dấu +.
- Quan sỏt và mụ tả ủặc ủiểm tản nấm sau cấy 10 ngày. - Xỏc ủịnh số lượng bào tửủược hỡnh thành.
Sau khi cấy 14 ngày, rửa sợi nấm, ủặt ủĩa nấm trong tủ 12 giờ sỏng 12 giờ
tối trong 3 ngày ủể nấm sinh bào tử. Dựng 20ml Tween 20 với nồng ủộ 1/10.000 ủể
rửa bào tử. Lấy 0,1 ml nước tween 20 cú bào tử cho lờn lam kớnh, ủậy lamen lại sau
ủú ủưa vào vựng ủếm và ủặt lờn kớnh hiển vi quang học 10X , ủếm số bào tử ủược hỡnh thành, ủếm 5 quang trường. Từủú tớnh số bào tử trong 1 ml ủể so sỏnh.
* Khả năng ức chế của thuốc Lilacter 0,3SL ủối với sự phỏt triển của nấm
Pyricularia oryzae trờn mụi trường nhõn tạo (mụi trường PSA)
- Thớ nghiệm ủược tiến hành với cỏc cụng thức sau: Cụng thức 1: Nồng ủộ 0,05%
Cụng thức 2: Nồng ủộ 0,10% Cụng thức 3: Nồng ủộ 0,15% Cụng thức 4: Nồng ủộ 0,20%
- Tiến hành nấu mụi trường PSA, hấp khử trựng ủể nguội ủến 60oC, hũa từng lượng thuốc thớ nghiệm (theo ủỳng nồng ủộ) vào nước cất vụ trựng, rồi ủổ
vào mụi trường PSA theo nồng ủộ thớ nghiệm lắc ủều, ủổ mụi trường cú thuốc ra
ủĩa Petri ủể nguội, cấy nấm Pyricularia oryzae Cav. vào giữa ủĩa, ủo ủường kớnh tản nấm sau khi cấy ở cỏc ngày 2, 4, 6, 8, 10 sau khi cấy. Tất cả cỏc ủĩa này ủược
ủặt trong tủủịnh ụn nhiệt ủộổn ủịnh từ 26- 28oC.
- Tớnh hiệu lực của thuốc ở ngày thứ 10 sau khi cấy theo cụng thức Abbot.
3.4.3. Phương phỏp nghiờn cứu trong nhà lưới
* Phương phỏp lõy bệnh nhõn tạo
Chuẩn bị cõy chủ
- Ngõm hạt lỳa giống nảy mầm, ủem gieo vào cỏc khay nhụm cú bựn. Mỗi khay gieo 4 giống, mỗi giống hai hàng, mỗi hàng 10 hạt. Sau ủú ủặt cỏc khay vào bể, chăm súc cho cõy phỏt triển bỡnh thường. Sau khi gieo ủược khoảng 20 - 22 ngày (3 - 4 lỏ) tiến hành phun dung dịch bào tử ủể lõy bệnh.
Chuẩn bị nguồn bào tử ủể lõy bệnh
Nguồn nấm ủược lấy từống PSA nghiờng cấy vào ủĩa mụi trường cỏm agar, mỗi mẫu phõn lập cấy 2 ủĩa, mỗi ủĩa cấy 3 ủiểm, sau ủú ủặt ủĩa ủó cấy vào tủủịnh ụn 26- 28oC trong 2 tuần. Trong thời gian ủú sợi nấm sẽ mọc kớn mụi trường. Lấy
ủĩa mụi trường ra khỏi tủ, dựng bỡnh tia phun nước cất khụng ion vào và dựng chổi lụng quột ủi quột lại nhiều lần trờn mặt ủĩa, rồi lại dựng bỡnh tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho hết nước, nghiờng ủĩa quột khụ mặt thạch (Mỗi mẫu phõn lập rửa bằng một chổi, rửa xong luộc chổi trong nước sụi). Cỏc ủĩa ủó rửa xong ủược
ủặt trong tủ 12 giờ sỏng, 12 giờ tối. Sau 3 ngày, bào tử ủó hỡnh thành. Dựng nước cất vụ trựng cú pha Tween 20 với nồng ủộ 1/10.000 ủể rửa và lọc bào tử (rửa 20
ml cho một ủĩa petri). Lấy một dung dịch bào tử ủó ủược lọc ở mỗi mẫu phõn lập nhỏ lờn lam, soi dưới kớnh hiển vi. ðếm số bào tử trờn quang trường 10X, ủếm 3 quang trường. ðiều chỉnh dung dịch ủể cú khoảng 30 - 50 bào tử trờn một quang trường, tương với 105 bào tử/ 1ml.
Lõy nhiễm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dựng bỡnh phun cầm tay loại cú thể tớch 0,5l ủể phun dung dịch bào tử lờn cỏc khay lỳa. Phun ướt ủều khắp lỏ lỳa rồi ủặt cỏc khay ủó ủược lõy nhiễm vào trong tủ lõy nhiễm. Phun mự giữ ẩm liờn tục trong vũng 24 giờ (ẩm ủộ > 90%). Sau khoảng thời gian ủú, ủem lỳa ủó lõy nhiễm ra ngoài nhà lưới ủặt dưới ỏnh sỏng tỏn xạ, tưới ủầy ủủ cho lỳa ủể lỳa vẫn tiếp tục phỏt triển bỡnh thường.
ðỏnh giỏ
Sau 7 ngày lõy nhiễm tiến hành ủỏnh giỏ phản ứng của cỏc giống lỳa theo thang phõn cấp của Kato,1993 [49].
Cấp 0: Khụng cú vết bệnh, khỏng cao (HR)
Cấp 1: Vết bệnh là chấm nhỏ bằng ủầu kim, khỏng (R) Cấp 2: Vết bệnh to hơn màu nõu nhạt ủến nõu tối, khỏng (R) Cấp 3: Vết bệnh to hơn cú màu xỏm ở giữa vết bệnh, nhiễm (S)
Cấp 4: Vết bệnh ủiển hỡnh (hỡnh thoi màu xỏm ở giữa), nhiễm nặng (HS)
Cấp 0, 1, 2: khỏng bệnh Cấp 3, 4: nhiễm bệnh
* Phương phỏp xỏc ủịnh mó số chủng sinh lý nấm Pyricularia oryzae Cav.
- ðỏnh giỏ phản ứng khỏng bệnh của 12 giống lỳa chỉ thị của Nhật Bản với cỏc mẫu phõn lập nấm Pyricularia oryzae Cav. bằng phương phỏp lõy bệnh nhõn tạo. Mỗi giống lỳa này ủều cú gen khỏng bệnh ủạo ụn khỏc nhau ủó ủược xỏc ủịnh và ủược mó hoỏ bằng cỏc chữ số.
- Từ kết quả phản ứng khỏng, nhiễm của 12 giống lỳa chỉ thị của Nhật Bản với cỏc mẫu phõn lập nấm Pyricularia oryzae Cav. và dựa vào mó số của cỏc giống lỳa chỉ thịủể xỏc ủịnh mó số của cỏc chủng sinh lý của nấm Pyricularia oryzae Cav. bằng cỏch cộng tất cả cỏc mó số của cỏc giống lỳa cú phản ứng nhiễm bệnh lại với nhau theo thứ tự hàng thập phõn, hàng ủơn vị, hàng chục và hàng trăm.
* ðỏnh giỏ hiệu lực thời gian của thuốc Lilacter 0,3SL (0,83 lớt/ha) ủối
với bệnh ủạo ụn trờn mạ trong ủiều kiện nhà lưới
- Thớ nghiệm ủược tiến hành với cỏc cụng thức sau:
Cụng thức 1: Lõy bệnh trước 1 ngày sau ủú phun thuốc. Cụng thức 2: Phun thuốc trước 1 ngày sau ủú lõy bệnh. Cụng thức 3: Phun thuốc trước 3 ngày sau ủú lõy bệnh. Cụng thức 4: Phun thuốc trước 5 ngày sau ủú lõy bệnh.
ðối chứng: Khụng phun thuốc.
- Thớ nghiệm ủược tiến hành trong ủiều kiện nhà lưới, chủng nấm sử dụng
ủể lõy nhiễm là chủng mang mó số 040.2; giống thớ nghiệm là giống Q5.