- Phủ bản bằng 50àl FSH và LH chuẩn (do hóng CALBIOTECH của Mỹ sản xuất)
- Cho 50 ml huyết thanh, của bũ chậm ủộng dục vào cỏc giếng - ðưa vào mỗi giếng 100 àl FSH hoặc LH gắn enzym
- ðem ủ bản 30 phỳt ở nhiệt ủộ phũng - Rửa bản 3 lần bằng washing buffer;
- ðưa vào mỗi giếng 100 àl dung dịch cơ chất TMB - ðem ủ bản ở nhiệt ủộ phũng trong 5-10 phỳt; - Cho vào mỗi giếng 50 àl dừng phản ứng ;
- ðọc phản ứng bằng mỏy ủo ELISA ở bước súng 410nm.
Lưu ý: vỡ thớ nghiệm ủũi hỏi ủộ chớnh xỏc rất cao nờn mỗi mẫu cần lặp lại ớt nhất 2 lần (mỗi mẫu làm vào 2 giếng) theo hỡnh sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A S1 S1 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33 B S2 S2 2 2 10 10 18 18 26 26 34 34 C S3 S3 3 3 11 11 19 19 27 27 35 35 D S4 S4 4 4 12 12 20 20 28 28 36 36 E S5 S5 5 5 13 13 21 21 29 29 37 37 F S6 S6 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38 G H H 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39 H L L 8 8 16 16 24 24 32 32 40 40 Ghi chỳ: Cỏc giếng nhựa ở cột dọc 1 và 2 chứa mẫu chuẩn ủể so sỏnh, trong ủú:
S1 - S2: Dóy dung dịch FSH và LH chuẩn cú nồng ủộ (mlU/ml) lần lượt LH: 0, 3.1, 6.25, 12.5, 25, 50.(mlU/ml).
H: mẫu chuẩn cú nồng ủộ FSH và LH cao L: mẫu chuẩn cú nồng ủộ FSH và LH thấp
H và L luụn ủược ủo ở mọi lần thớ nghiệm nhằm tớnh hệ số sai khỏc và ủộ lệch chuẩn giữa cỏc lần thớ nghiệm
- Cỏc giếng cũn lại cú số từ 1 ủến 40 thuộc cỏc cột dọc từ 3 ủến 12: là mẫu chứa FSH và LH cần ủịnh lượng, mỗi mẫu 2 giếng ủỏnh số thứ tự giống nhau.
Từ kết quả thu ủược ta tiến hành vẽ ủường cong chuẩn biểu thị mối tương quan giữa mật ủộ quang học (Optical Density - OD) với nồng của dóy dung dịch chuẩn. ðường cong chuẩn LH, FSH cú dạng như sau:
ðồ thị 2.4 Mối tương quan giữa mật ủộ quang học (OD) và nồng ủộ FSH (mlU/ml)
(ủường chuẩn trờn ủược dựng theo chương trỡnh phần mềm TableCurve 2D phiờn bản số
4).
ðối chiếu kết quả về mật ủộ quang học với ủường cong chuẩn biểu thị nồng ủộ FSH và LH của dóy dung dịch chuẩn, ta xỏc ủịnh ủược nồng ủộ của FSH và LH trong mẫu cần ủịnh lượng.