3. Nội dung, nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.4.1-Nguyên liêu, dụng cụ nghiên cứu
Các nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm là các trang thiết bị và cơ sở vật chất của cơ quan Thú y vùng 2 và Trung tâm Chẩn đoán Thú Y quốc gia. 3.4.2- Ph−ơng pháp lấy, xử lý mẫu
Với gia cầm, thủy cầm và động vật có vú còn sống lấy mẫu bệnh phẩm là dịch ngoáy mũi , ngoáy họng, khí quản, dịch ngoáy ổ nhớp, mẫu phân, máu.
Với gia cầm, thủy cầm đ chết, lấy mẫu là khí quản, dịch khí quản, dịch rửa phế nang, phổi, các tổ chức phủ tạng khác: No, gan, lách, thận, tuyến tụy... lấy mẫu phải lấy đúng lúc, đúng kỹ thuật. Các mẫu dùng để phân lập virus tốt nhất đ−ợc lấy trong vòng 3 ngày đầu sau khi gia cầm có biểu hiện triệu chứng bệnh cúm.
Mẫu đ−ợc giữ ở nhiệt độ 40C và xét nghiệm ngay trong vòng 48h. Nếu cần bảo quản thời gian dài hơn thì giữ ở -700C.
a) Xử lý bệnh phẩm.
- Bệnh phẩm là dịch ngoáy khí quản, hậu môn và phân.
- Bệnh phẩm đ−ợc làm ấm, thêm kháng sinh, lắc trộn đều để nhiệt độ phòng 30 phút, dịch ngoáy hậu môn và phân có thể lọc qua màng lọc sau đó dùng để tiêm truyền.
b) Bệnh phẩm là tổ chức.
Tiến hành nghiền mẫu dịch phẩm là tổ chức trong PBS PH 7,2 thành huyền dịch 10%. Ly tâm huyền dịch 1000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. Bổ sung kháng sinh 10x (đặc 10 lần) gồm kanamycin,
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 25
penecillin, streptomycin theo tỷ lệ 1/10 vào huyền dịch bệnh phẩm trên, để trong tủ lạnh 40C ít nhất trong vòng 2h để kháng sinh diệt các tạp khuẩn. Huyền dịch bệnh phẩm đ xử lý, nếu ch−a dùng phân lập ngay thì bảo quản ở -700C.
c) Bệnh phẩm là máu.
Máu gia cầm đ−ợc đựng trong ống ly tâm nhỏ, ly tâm với tốc độ 1500 vòng trong 5 phút để tách riêng huyết thanh. Dùng pipette hút huyết thanh ở trên đ−a sang ống khác. Huyết thanh này bảo quản ở 40C đ−ợc dùng trong phản ứng HI, sau đó có thể l−u giữ ở -300C.
3.4.3- Ph−ơng pháp xác định kháng nguyên 3.4.3.1- Phân lập virus trên trứng có phôi 3.4.3.1- Phân lập virus trên trứng có phôi
- Chọn trứng có phôi 9-10 ngày tuổi khoẻ mạnh, 3-5 trứng/bệnh phẩm.
- Lau trứng bằng cồn 700 và đục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi.
- Dùng syringe 1ml hút dịch bệnh phẩm tiêm vào xoang niệu mô với l−ợng 0,2ml/ trứng.
- Gắn vết tiêm bằng keo dán, ấp trứng 2-3 ngày ở nhiệt độ 370C. - Theo dõi sau khi tiêm, ngày 02 lần soi trứng, trứng chết đ−ợc cất vào tủ lạnh 40C để kiểm tra. Sau thời gian ấp, trứng chết hoặc sống đ−ợc cất vào tủ lạnh 40C qua đêm hoặc ít nhất 4h tr−ớc khi thu hoạch.
- Thu hoạch dịch niệu mô vào ống nghiệm thu riêng trứng chết và trứng sống.
3.4.3.2- Kiểm tra n−ớc trứng bằng phản ứng HA
- Nhỏ 25 àl PBS 0,01M vào đĩa 96 giống chữ V từ giếng 1 đến giếng 12 của mỗi hàng.
- Cho 25 àl dịch niệu mô vào giếng 1 trộn đều.
- Pha long kháng nguyên bằng cách chuyển 25àl dịch niệu mô từ giếng 1 sang giếng thứ 2, tuần tự đến giếng thứ 11 thì bỏ đi 25àl.
- Nhỏ thêm 25 àl PBS vào các giếng.
- Nhỏ 25 àl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng trên. - Lắc đĩa bằng máy hoặc bằng tay.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 26
- ủ đĩa ở nhiệt độ phòng, thời gian 40 phút. - Đọc kết quả:
+ Phản ứng d−ơng tính, hồng cầu ng−ng kết thành hạt lấm tấm. + Phản ứng âm tính hồng cầu lắng xuống đáy thành cục màu đỏ. Hiệu giá HA vủa virus đ−ợc tính ở độ pha long kháng nguyên cao nhất còn hiện t−ợng ng−ng kết hồng cầu. Ví dụ: Nếu ở độ pha long 1/64 còn có ng−ng kết thì hiệu giá HA là 1/64.
- Nếu HA d−ơng tính, chứng tỏ có virus. Tiếp tục giám định bằng phản ứng HI với kháng huyết thanh chuẩn của một Subtype H virus cúm A và kháng huyết thanh chuẩn Newcastle để xác định loại virus phân lập.
- Nếu HA âm tính mà phôi chết, có bệnh tích phôi thì phải lấy n−ớc trứng tiêm truyền lần 2.
- Nếu HA âm tính mà phôi phát triển bình th−ờng, không cần làm lại. 3.4.3.3- Giám định virus phân lập bằng phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu HI (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pha kháng nguyên 4 HA/25àl: Lấy độ pha long cuối cùng có phản ứng ng−ng kết hồng cầu 1 HA nhân với 4.
Ví dụ: Hiệu giá HA của dịch niệu mô là 1/64 đơn vị 4HA= 1/64 x 4 = 1/16
Nh− vậy trộn 1 phần n−ớc trứng với 15 phần PBS để đạt đ−ợc dung dịch kháng nguyên 4HA.
- Chuẩn độ kháng nguyên 4HA:
Sau khi pha kháng nguyên 4HA phải đ−ợc chuẩn độ lại. Tiến hành nh− phản ứng xác định hiệu giá HA.
+ Pha chuẩn: Ng−ng kết xẩy ra ở 2 giếng đầu.
+ Pha không chuẩn: Nếu ng−ng kết đến giếng thứ 3 tức là thừa kháng nguyên. Nh− vậy hỗn dịch kháng nguyên có 8HA phải đ−ợc pha long (có thể gấp đôi) để có ng−ng kết đến giếng thứ 2. Kháng nguyên long ng−ng kết chỉ ở giếng 1 tức là thiếu kháng nguyên có thể thêm 01
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 27
l−ợng kháng nguyên bằng với l−ợng kháng nguyên ban đầu để có ng−ng kết ở giếng thứ 2.
- Tiến hành phản ứng HI
+ Nhỏ 25àl PBS vào các giếng của đĩa 96 giếng chữ V từ thứ 01 đến 12. + Nhỏ tiếp 25àl kháng huyết thanh vào giếng đầu tiên trộn đều. + Pha long kháng huyết thanh theo cơ số 02, bằng cách chuyển 25àl kháng huyết thanh từ giếng 01 sang giếng 02 và tuần tự đến giếng 11 thì bỏ đi 25àl.
+ Nhỏ 25àl kháng nguyên 4HA vào các giếng từ 01 đến 11. Thêm 25àl PBS vào đối chứng hồng cầu (giếng 12).
+ Lắc đĩa và ủ nhiệt độ phòng 30 phút.
+ Nhỏ 25àl dung dịch hồng cầu vào tất cả các giếng của đĩa lắc đều. + Để nhiệt độ phòng 40 phút.
(Trên 01 đĩa có thể tiến hành nhiểu phản ứng HI với nhiều mẫu kháng huyết thanh của các Subtype khác nhau).
- Đọc kết quả:
+ Phản ứng d−ơng tính: Hồng cầu lắng xuống đáy. Nh− vậy virus phân lập và kháng huyết thanh chuẩn t−ơng ứng với nhau.
+ Xác định Subtype: Một virus phân lập đ−ợc xác định Subtype khi phản ứng với một kháng huyết thanh chuẩn với hiệu giá cao hơn 4 lần so với các kháng huyết thanh chuẩn khác. Hiệu giá càng cao chứng tỏ sự t−ơng đồng virus phân lập với kháng huyết thanh chuẩn càng lớn.
3.4.3.4- Ph−ơng pháp RT/PCR
a) Chiết tách ARN từ mẫu dịch ngoáy (Swab) dùng kít Qiagen (R) Rneasy.
- Lắc mạnh bằng máy ống chứa dịch ngoáy và chuyển l−ợng 500àl sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu. Cho 500àl Qiagen (R) buffer RLT có β-ME vào ống ly tâm trên. Lắc đều bằng máy Vontex.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 28
- Ly tâm (bằng máy Spin dwn) để dịch bệnh phẩm đọng trên nắp trôi xuống đáy. Cho 500àl cồn ete, lắc mạnh bằng Vontex, ly tâm mẫu đ bị dung giải trong 5 phút ở tốc độ 5000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.
- Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung giải sang cột Rneasy (R) Qiagen đ ghi sẵn ký hiệu mẫu. Ly tâm trong 15 giây tốc độ ≥ 8000 Xg ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra mẫu đ thấm qua cột lọc ch−a. Lặp lại b−ớc này cho đến khi toàn bộ mẫu đ thấm qua cột lọc.
Ngoài ra có thể dùng ống hút Quivac (R) để hút dịch mẫu và rửa thông qua cột thu mẫu. Ph−ơng pháp này làm tăng hiệu quả và không phải ly tâm cột lọc.
- Bổ sung 700àl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột Rneasy (R) Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc độ ≥ 8000 Xg, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc. Cho 500àl RPE buffer vào cột Rneasy (R) và ly tâm trong vòng 15 giây ở tốc độ ≥ 8000 Xg, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
- Lặp lại b−ớc trên 02 lần với dung dịch RPE buffer. Sau lần rửa cuối cùng thay ống thu mẫu mới loại 2àl vào cột lọc. Ly tâm cột lọc trống không trong 02 phút ở tốc độ tối đa (12000V/phút) bỏ ống thu mẫu.
- Đặt cột lọc vào ống thu hoạch hoặc ống 1,5 ml đ đ−ợc ghi sẵn ký hiệu mẫu. Cho 50àl Rneasy free H20 vào cột lọc. Chú ý không đ−ợc chạm đầu tip vào một thạch Sillica trong cột lọc. ủ ở nhiệt độ phòng ít nhất 01 phút. Tách ARN bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở 10.000 vòng/phút bỏ cột lọc Rneasy (R).
- Bảo quản mẫu ARN thu đ−ợc ở 40C trong thời gian ngắn tr−ớc khi làm RT-PCR. Nếu làm sau 24h, mẫu phải bảo quản ở -200C hoặc thấp hơn.
b) Tiến hành phản ứng RT/PCR. * Dụng cụ: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- ống 25àl Smart Cycler (R) (Catalo # 900-0022 hoặc 900-0003, Lepheid (R) Smart Cycler, Sunnyvale, CA).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 29
- Giá ống phản ứng PCR làm lạnh đ−ợc và máy ly tâm ống nhỏ. Cả hai thiết bị này đ−ợc cung cấp kèm theo hệ thống máy Smart Cycler (R).
- Hệ thống bơm hút chân không 24 van Qiavac (R) có khả năng hút 18-20 lít/phút.
* Nguyên liệu:
- N−ớc cất vô trùng (Rneasy-free).
- RNA đối chứng d−ơng tính M, H5 và H7 (đ−ợc NVSL cung cấp). - Cồn tuyệt đối.
- Isopropanol, 99+% tinh khiết. - Cloroform, 99+% tinh khiết.
- Triol (R) LS reagent (Invitrogen, cat# 10296-010 hoặc 10296-028). - Kít chiết tách Qiagen (R) Rmeasy Extraction (cat # 7410450 prep hoặc # 74106250 prep).
- Kít RT/PCR One-Step RT/PCR với Platinium taq DNA polymerase (cat @ 10928-034 hoặc 10928-042, invitrogen (R)).
- Mẫu dò Primer: có thể đặt primer và mẫu dò Integarated DNA technogies, trình tự chuỗi của mẫu dò và primer cho RT/PCR phát hiện cúm gia cầm (xin xem phụ lục 2).
- Rnase inhibitor, 40 unit/àl (Promega, cat # N2511 hoặc N2515). - MgCl2 25àM (Promega, cat # 3511 hoặc A3513).
- Đệm TE PH 8.0,1 x (Promega # V6231 hoặc V6232). - 14.3M *
β-Mercap toetanol (β-ME) (Sigma M6250).
* Chú ý vì độc phải sử dụng băng hút, đeo găng.
- Hạt chất phản ứng M và H5 cho AIV RT/PCR đ đ−ợc chuẩn bị bởi Cêphid (R) để sử dụng cho các xét nghiệm M và H5 mỗi hạt chất phản ứng đủ để cho 4 phản ứng loại 25àl. Mỗi giọt chứa Primer và mẫu dò đặc hiệu, KCl, MgCl2, đệm HEPES thêm vào đó giọt M gồm cả chất điều khiển trong (IC). Mục đích IC là phát hiện một âm tính giả tạo ra từ các chất ức chế không đặc hiệu của quá trình nhân gen.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 30
- Chất điều khiển trong M là một ARN chuỗi đơn đ phiên m dài 228bp. Nó chứa chuỗi bổ sung với Primer tiến M ở đầu 5’ và primer lùi ở đầu 3’, và một chuỗi bên trong (Internal) để gắn với mẫu dò IC. Hạt M gồm có một mẫu dò đánh dấu FAM để phát hiện gen M, và mẫu dò đánh dấu Cal- Flour Red610cho IC.
Hạt chất phản ứng H5 gồm 2 Primer tiến, một để phát hiện AIV H5 dòng Bắc Mỹ và một để phát hiện AIV H5 dòng Âu-á. Chất phản ứng đ−ợc chia vào các ống 0,5ml có thể sử dụng để hoàn nguyên, sử dụng với d NTP và Enzime của kít Qiagen (R) RT/PCR one step. Chất phản ứng có thể bảo quản trong túi thiếc ở 40C trong 6 tháng. Không cởi bỏ túi nếu ch−a sử dụng.
* Tiến hành sao m ng−ợc và PCR: Phải tuyệt đối vô trùng, buồng cấy, tủ ấm cùng các dụng cụ và khu vực nhân gen (Thermal cycling area). Không đ−ợc để các chất có ARN/ADN vào khu vực “sạch” và phải thay găng tay mỗi thao tác tiếp theo.
- Trong buồng vô trùng chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (Master mix) với các thành phần sau đủ dùng cho số l−ợng mẫu cần xét nghiệm. Liều l−ợng cho từng mẫu (xem phụ lục 3).
- Quy trình này đ−ợc áp dụng cho máy nhân gen Cypheid (R) Smart Cycler (Cephied (R), Sunny val, CA). Chế độ chạy RT/PCR cho máy Smart Cycler đ−ợc h−ớng dẫn phụ lục 4 và 5.
- Phản ứng Real time RT/PCR đ−ợc tiến hành với những thành phần sau cùng với cặp mồi và chu kỳ thích hợp. Khối l−ợng phản ứng với các ống phản ứng đ−ợc đặt trong giá đựng ống lạnh và dùng các đầu pipet có lọc.
- Chuẩn bị hỗn dịch phản ứng (mọi thứ trừ mẫu ARN) bằng pipet; n−ớc, 5 X reaction buffer (có trong bộ kit) dNTPs (có trong bộ kit) với l−ợng cho từng phản ứng đ−ợc tính theo bảng 4. Các nguyên liệu để trong ngăn đá kể cả MgCl2 phải đ−ợc lắc bằng Votex và ly tâm tr−ớc khi lấy ra bằng Pipet. Tiếp đến cho Rnease Inhibitor và Enzime. Cho mẫu dò vào
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 31
sau cùng, trộn đều và ly tâm. Khi cho mẫu dò vào hỗn dịch tránh để tiếp xúc với ánh sáng.
- Chuyển Master mix sang buồng cho mẫu ARN và cho hỗn dịch phản ứng (17àl) vào ống Smar cycler.
- Cho 8àl mẫu ARN vào ống Smart cycler bằng pipet chuyên dùng cho lấy mẫu ARN. Đóng nắp ống, số ống phản ứng t−ơng ứng với phiếu xét nghiệm. Cho 8àl ARN đối chứng d−ơng vào ống đối chứng d−ơng tính và 8àl n−ớc sạch R Nease vào ống đối chứng âm tính. ARN đối chứng d−ơng tính đ−ợc pha long bởi cán bộ xét nghiệm ở độ pha long thích hợp có ng−ỡng chu kỳ khoảng 25.
- ống phản ứng đ−ợc đẩy bọt khí ra ngoài từ cửa sổ đọc của PCR. Bọt khí trong ống cho biết l−ợng hỗn dịch RT/PCR master mix không đủ hoặc thiếu mẫu ARN.
- Đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chu kỳ chạy PCR, bắt đầu chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu đối chứng d−ơng tính, âm tính vào phần ký hiệu mẫu (sample identification) trong bảng kết quả. L−u ch−ơng trình chạy máy. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cài đặt ch−ơng trình phân tích dữ liệu cho máy chu kỳ nhiệt Cephei d (R) Smart Cycler và chạy ch−ơng trình.
* Phân tích kết quả xét nghiệm
- Độ đặc hiệu của các ph−ơng pháp xét nghiệm Matrix, H5, H7: Ph−ơng pháp xét nghiệm Maxtrix virus cúm gia cầm đ−ợc dùng để xét nghiệm tất cả các phân nhóm của AIV, ng−ợc lại ph−ơng pháp đặc hiệu xác định phân nhóm H5, H7 dùng giám định AIV H5 và H7 chủng Bắc Mỹ. Ph−ơng pháp xét nghiệm H5 đ cho thấy khả năng phát hiện AIV H5N1 chủng Asean (Châu á). Vì ph−ơng pháp xét nghiệm Maxtrix H5 hay H7 (khoảng 10 lần) nên th−ờng dùng Test này đi kiểm tra tất cả các mẫu. Mẫu d−ơng tính Matrix và cả H5, H7 cho ta khẳng định có virus cúm gia cầm (có ARN của virus cúm gia cầm). Tuy nhiên mẫu d−ơng tính
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 32
với Matrix bằng kỹ thuật RT/PCR mà âm tính với H5 và H7 thì vẫn có thể chứa ARN của phân nhóm H5, H7 nh−ng do số l−ợng ARN thấp hơn khả năng phát hiện của kỹ thuật xét nghiệm này hoặc có phân nhóm khác ngoài H5, H7 đang gây bệnh. Những mẫu bệnh phẩm này đ−ợc xem là mẫu nghi ngờ.
Ph−ơng pháp xét nghiệm matrix, H5, H7 cũng có thể phát hiện các mẫu bệnh d−ơng tính giả. Những mẫu có Ct bằng 35 hoặc lớn hơn đ−ợc xem là d−ơng tính nghi ngờ và đ−ợc xét nghiệm lại bằng RT/PCR.
Tất cả mẫu bệnh nghi ngờ và mẫu chỉ cho d−ơng tính Matrix với kỹ thuật RT/PCR cần đ−ợc kiểm tra lại bằng ph−ơng pháp phân lập virus tr−ớc khi thông báo kết quả d−ơng tính. Tất cả các mẫu ch−a chắc chắn thì phải xét nghiệm lại.
- Giá trị Ct của đối chứng d−ơng tính ARN đ−ợc sao m: Đối chứng d−ơng tính ARN đ sao m đ−ợc pha long ở hàm l−ợng sử dụng cho giá trị Ct khoảng 25. Khi đối chứng có Ct cao hơn 29 thì phải làm lại để xét