2. Tổng quan tài liệu
2.7.1- Miễn dịch không đặc hiệu
Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu là hàng rào phòng thủ đầu tiên chống lại bất cứ tác nhân ngoại lai nào xâm nhập vào cơ thể nó có tính chất không đặc hiệu, đ−ợc thể hiện nh−:
- Rào cản vật lý: gồm da, niêm mạc, màng nhày, khu hệ vi sinh vật th−ờng trú, các lông mao, axit trong dạ dày.
- Các yếu tố kháng khuẩn có trong dịch tiết của cơ thể gồm các Enzime interferon, các yếu tố gây hoại tử tế bào.
- Bổ thể và các tế bào thực bào, tế bào diệt tự nhiên. [ 14 ] 2.7.2- Miễn dịch đặc hiệu
Miễn dịch đặc hiệu là trạng thái miễn dịch xuất hiện khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên. Miễn dịch đặc hiệu có hai đặc điểm cơ bản khác miễn dịch tự nhiên là khả năng nhận diện và trí nhớ miễn dịch.
2.7.2.1- Miễn dịch trung gian tế bào
Tế bào Lympho T, B và các đại thực bào có vai trò quan trọng trong miễn dịch trung gian tế bào. Tế bào T nhận diện kháng nguyên lạ sau khi nó đ đ−ợc các tế bào đại thực bào xử lý và trình diện kháng nguyên. Tế bào thành thục trong túi Fabricius nhận biết các kháng nguyên hòa tan và trình diện chúng trên bề mặt. Các tế bào mang dấu ấn TCD4 nhận biết các tế bào có kháng nguyên gắn với MHC lớp II, sau đó tiết ra các lymphokin kích thích các tế bào B hoạt hóa thành t−ơng bào sản xuất kháng thể tiêu diệt kháng nguyên. Các tế bào TCD8 (T độc) có tác dụng nhận biết kháng nguyên gắn với MHC lớp I, sau đó hoạt hóa trở thành T độc tiêu diệt kháng nguyên.
Các tế bào T diệt tự nhiên có khả năng nhận biết nhiều loại kháng nguyên ngoại lai và kháng nguyên của chính cơ thể vật chủ đ bị biến đổi, đóng vai trò quan trọng trong tuần tra miễn dịch và tiêu diệt các tế bào lạ [14]. 2.7.2.2- Đáp ứng miễn dịch dịch thể
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 17
Globulin miễn dịch (Ig- immuno globulin) hay kháng thể tiết bởi tế bào B là thành phần chính của miễn dịch dịch thể. Kháng thể có thể hiện diện trong các dịch của cơ thể nh−ng đ−ợc định l−ợng trong huyết thanh hoặc huyết t−ơng. Gà có 3 lớp chính là IgM, IgY và IgA.
IgG của gia cầm lớn hơn của động vật có vú, th−ờng đ−ợc gọi là IgY. IgY có thể là tiền chất tổ tiên của IgE và IgG của động vật có vú.
IgA là globulin miễn dịch quan trọng nhất thuộc miễn dịch màng nhầy, IgA bảo vệ màng nhầy chống lại các mầm bệnh đặc biệt là virus bằng cách trung hòa và ngăn cản sự liên kết của chúng với Receptor trên bề mặt tế bào đích.
IgM đ−ợc tìm thấy trên bề mặt hầu hết các tế bào B và là kháng thể đ−ợc sản xuất ra đầu tiên trong miễn dịch sơ cấp. Sau đó các tế bào đ−ợc chuyển sang sản xuất IgG hoặc IgA (sự chuyển lớp). Khả năng gắn kết kháng nguyên của các kháng thể không thay đổi trong hoặc sau khi chuyển lớp. Các Cytokin IL-4, TGF –β và IFN - γ kích thích tế bào B trải qua sự chuyển lớp.
Một đáp ứng miễn dịch điển hình của gia cầm bắt đầu bằng sự sản xuất ra IgM. Sau vài lần đáp ứng miễn dịch chuyển sang sản xuất IgG, đây là kháng thể chính sinh ra miễn dịch thứ phát và chiếm −u thế trong máu gia cầm. Những virus bị trung hòa không thể bám vào điểm tiếp nhận trên bề mặt của tế bào đích vì vậy chúng không thể tái tổ hợp. Kháng thể kết hợp với mầm bệnhh cũng có thể hoạt hóa bổ thể và sản xuất protêin bổ thể mới. Protêin bổ thể gắn với Receptor của thể thực bào, kích thích cho thực bào phân hủy mầm bệnh [14].
* Trí nhớ miễn dịch:
Sau khi kháng nguyên lần đầu vào cơ thể kích thích cơ thể sinh đáp ứng miễn dịch, nh−ng chỉ tồn tại thời gian ngắn. Kết quả của lần đáp ứng miễn dịch này tạo ra một nhóm các tế bào Lympho T nhớ, khi kháng nguyên cùng loại xâm nhập lần sau chúng làm cho đáp ứng miễn dịch cơ thể nhanh hơn, mạnh hơn. Đáp ứng miễn dịch thứ phát xuất hiện ngay từ đầu đ có sự tham gia của T nhớ chúng nhanh, mạnh hơn và tồn tại lâu hơn so với đáp ứng miễn dịch tiền phát. Đây là cơ sở của việc tiêm phòng vắc xin cúm và tiêm nhắc lại lần sau ở gia cầm.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 18
* Các yếu tố ảnh h−ởng đến sự hình hành kháng thể: - Bản chất kháng nguyên.
- Đ−ờng xâm nhập của kháng nguyên. - Liều l−ợng kháng nguyên.
- Số lần đ−a kháng nguyên vào cơ thể. - Chất bổ trợ.
- Trạng thái cơ thể [29 ].
2.8- Sử dụng vắc xin phòng chống bệnh cúm gia cầm
2.8.1- Các loại vắc xin đang dùng hiện nay
2.8.1.1- Vắc xin truyền thống
Vắc xin cúm gia cầm sản xuất từ phôi gà đ−ợc nuôi cấy virus vắc xin sau đó vô hoạt bằng hóa chất. Kháng nguyên virus sau khi đ−ợc bổ sung thêm chất bổ trợ nhũ dầu để tăng tính kháng nguyên. Vắc xin có hiệu lực càng cao khi Subtype virus vắc xin và virus thực địa có sự t−ơng đồng [17 ].
* Vắc xin vô hoạt đồng chủng:
Qua thực tế đ chứng minh loại vắc xin này có hiệu lực cao trong việc phòng bệnh, giảm l−ợng virus thải ra môi tr−ờng. Nh−ng nh−ợc điểm của loại vắc xin này là không phân biệt đ−ợc gia cầm đ đ−ợc tiêm vắc xin với gia cầm đ−ợc tiếp xúc với mầm bệnh tự nhiên, trừ những con đ−ợc cách ly riêng biệt. Ví dụ vắc xin H5N1 của hng Weike của Trung Quốc.
* Vắc xin vô hoạt dị chủng:
Loại vắc xin này chủng virus vắc xin có kháng nguyên H giống với chủng virus trên thực địa nh−ng có kháng nguyên N dị chủng. Đáp ứng miễn dịch sinh ra bởi kháng nguyên H đồng chủng, trong khi kháng thể kháng N của gia cầm tiêm phòng và gia cầm nhiễm cúm ngoài thực địa khác nhau. Ví dụ vắc xin vô hoạt dị chủng H5N2 của Intervet Hà Lan, vắc xin H5N2 của Weike Trung Quốc.
Trong hai loại vắc xin trên thì mức độ bảo hộ lâm sàng và giảm thải trừ virus ra môi tr−ờng của vắc xin đồng chủng tốt hơn. Việc lựa chọn vắc
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 19
xin dị chủng cho phép áp dụng chiến l−ợc DIVA nhằm phân biệt con nhiễm bệnh tự nhiên với con tiêm vắc xin [12], [17].
2.8.1.2- Vắc xin tái tổ hợp
Vắc xin tái tổ hợp cho phép phân biệt giữa động vật nhiễm bệnh và động vật tiêm vắc xin, vì chúng không sản sinh kháng thể chống lại kháng nguyên Nucleoprotein phổ biến ở tất cả các virus cúm gia cầm. Chỉ gia cầm nhiễm bệnh trên thực địa mới tạo ra kháng thể nhóm A (nucleoprotêin) và phát hiện ra kháng thể này qua phản ứng Elisa hoặc phản ứng kết tủa ng−ng kết kép trên thạch. Sử dụng vắc xin này đ−ợc giới hạn với những loài mà virus đích sẽ nhân lên hoặc chỉ giới hạn trong đàn gà có huyết thanh âm tính với virus đích. Ví dụ, vắc xin TROVaC (virus đậu tái tổ hợp với cúm H5) của Merial, và H5n1 của Weike Trung Quốc.
2.8.2- Tình hình sử dụng vắc xin cúm gia cầm trên thế giới
Việc sử dụng vắc xin cúm trên thế giới hiện nay vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau, có n−ớc không sử dụng biện pháp tiêm phòng, song cũng nhiều n−ớc xây dựng chiến l−ợc phòng chống cúm gia cầm mà việc tiêm phòng cho đàn gia cầm là biện pháp chủ đạo.
* Loại vắc xin đ−ợc phép sử dụng: - Vắc xin cúm vô hoạt.
- Vắc xin tái tổ hợp đậu gà với gen AI H5 nhận từ virus cúm của gà tây [31], [33].
* Tình hình sử dụng vắc xin ở một số n−ớc:
Số l−ợng vắc xin đ−ợc sử dụng ch−a đ−ợc các n−ớc thông báo cụ thể, nh−ng một số nguồn thông tin cho rằng Mexico đ sử dụng 1 tỷ 300 triệu liều vắc xin vô hoạt và 850 triệu liều vắc xin tái tổ hợp đậu gà trong ch−ơng trình chống bệnh cúm từ tháng 01/1995 và đ thanh toán đ−ợc bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao do virus H5N2, mặc dù virus H5N2 chủng độc lực thấp vẫn l−u hành. Indonexia cũng sử dụng vắc xin AI H5 vô hoạt. Từ năm 1995 Pakistan cũng sử dụng vắc xin phòng cúm ở các ổ dịch H7N3 thể độc lực cao. Các vắc xin vô hoạt H9N2 độc lực thấp đ và
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 20
đang đ−ơc sử dụng ở một số n−ớc Châu á, vùng cận đông và Đông Âu. Italia cũng sử dụng vắc xin vô hoạt nhũ dầu H7. Trung Quốc là n−ớc sử dụng vắc xin cúm nhiều nhất với 2 tỷ 830 triệu liều (tính từ tháng 12/2003 đến 4/2005), Trung Quốc có báo cáo về kết quả của 3 loại vắc xin đang sử dụng, bao gồm:
- Vắc xin vô hoạt chủng H5, N-28; đ−ợc phê chuẩn từ tháng 12/2003 và đ−ợc sử dụng rộng ri ở Trung Quốc trong các ổ dịch cúm gia cầm thể độc lực cao vào đầu năm 2004.
- Vắc xin vô hoạt cúm tái tổ hợp (Subtype H5N1, chủng Re 1) đ−ợc phê chuẩn tháng 01/2005. Vắc xin này đ−ợc đánh giá có hiệu lực cao và thời gian bảo hộ kéo dài. Thủy cầm đ−ợc tiêm vắc xin này không bị nhiễm và bài thải virus cúm.
- Vắc xin sống virus đậu tái tổ hợp với cúm gia cầm H5; đ−ợc phê chuẩn 01/2005. Sử dụng vắc xin này có thể phân biệt miễn dịch do tiêm phòng hay miễn dịch thụ động. [28], [27], [30].
2.8.3- Một số chú ý khi sử dụng vắc xin phòng chống virus cúm gia cầm - Khuyến cáo của OIE về việc sử dụng vắc xin phòng chống cúm gia cầm.
Theo quan điểm của OIE, FAO, thì vắc xin nên đ−ợc sử dụng thành một chiến l−ợc toàn diện phòng chống dịch cúm gia cầm, bao gồm 5 công đoạn là: An toàn sinh học, nâng cao nhận thức ng−ời dân, giám sát và chẩn đoán, loại bỏ gia cầm bệnh và sử dụng vắc xin. [ 26].
- Tr−ớc khi sử dụng vắc xin cần chú ý:
+ Vắc xin sử dụng phải cùng Subtype H và thực nghiệm có đủ khả năng bảo hộ chống lại sự xâm nhập virus thực địa.
+ Vắc xin đ−ợc sản xuất theo công nghệ chuẩn hóa để đảm bảo vắc xin hiệu quả và phù hợp về chủng virus.
+ Cần có kế hoạch về phân phối, sử dụng và bảo quản vắc xin.
+ Giám sát huyết thanh học và virus để xác định virus c−ờng độc có l−u hành trong đàn gia cầm đ−ợc dùng vắc xin hay không.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 21
- Ưu điểm của tiêm phòng vắc xin cúm.
+ Giảm đáng kể virus bài xuất trong đàn gia cầm nhiễm bệnh. + Tạo ra sự bảo hộ cho đàn gia cầm.
+ Giảm thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm. - Nh−ợc điểm.
+ Không phù hợp với quy định th−ơng mại quốc tế. Tiêm chủng đ−ợc chấp nhận nh− một biện pháp khống chế dịch cúm gà của OIE.
+ Những đàn gia cầm đ−ợc tiêm phòng không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng bệnh cúm, khó phát hiện dịch và khống chế dịch sớm [12]. 2.9- Tình hình sử dụng vắc xin cúm gia cầm ở Việt Nam
Từ tháng 7/2005. “Dự án sử dụng vắc xin nhằm khống chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm” đ đ−ợc triển khai tiêm phòng trên địa bàn cả n−ớc và thực hiện liên tục qua các năm. Một năm tiêm làm 2 đợt vào tháng 4-5 và tháng 9-10.
Trong giai đoạn I của dự án (2005-2006), đối t−ợng tiêm phòng là gà giống cụ kỵ, ông bà, bố mẹ; trứng gà th−ơng phẩm; gà thịt đ−ợc nuôi từ 70 ngày trở lên; vịt giống, vịt đẻ trứng th−ơng phẩm, gà chọi. Loại vắc xin đ−ợc sử dụng gồm vắc xin chết chủng H5N2 của hng Intervet và của Trung Quốc, tiêm cho gà lần đầu từ 8 ngày tuổi trở lên, tiêm lần 2 cách lần đầu 4 tuần và sau đó 6 tháng sau nhắc lại. Vắc xin chết chủng H5N1 của Trung Quốc, tiêm cho vịt lần đầu từ 15 ngày tuổi trở lên, tiêm lần 2 cách lần đầu 3 tuần và sau 4 tháng tiêm nhắc lại. Năm 2006 sử dụng thêm loại vắc xin sống tái tổ hợp đậu gà- cúm H5 (Vxin trovac của hng Merial) tiêm cho gà con một ngày tuổi ấp nở công nghiệp tr−ớc khi xuất bán.
Giai đoạn II của dự án (2007-2008), đối t−ợng tiêm phòng đ−ợc mở rộng thêm với ngan. Loại vắc xin đ−ợc sử dụng để tiêm: Vắc xin chủng H5N1 của Trung Quốc dùng chung cho gà, vịt; vắc xin H5N2 của Intervet dùng cho gà; vắc xin chết chủng H5N9 của hng Merial (Pháp - Mỹ) dùng cho ngan; vắc xin dùng cho gà con 1 ngày tuổi [3].
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 22
Theo kết quả giám sát huyết thanh học năm 2005-2006 đ đ−ợc công bố, tỷ lệ bảo hộ theo đàn gia cầm sau khi tiêm vắc xin 1-2 tháng đạt mức 53,8-56,2%. Và sau 3-4 tháng đạt mức 33,3-44,9%. Năm 2007 sau khi tiêm vắc xin 1 tháng, tỷ lệ bảo hộ theo đàn đạt mức 72%. Cũng theo các đánh giá cho rằng chiến l−ợc sử dụng vắc xin ở Việt Nam đ đạt đ−ợc kết quả khả quan trong thực tế [11]. Tuy nhiên vẫn cần tiếp tục giám sát sau tiêm phòng, bổ sung, hoàn thiện một số điểm để công tác khống chế, thanh toán bệnh cúm gia cầm thành công.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 23
3. Nội dung, nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1- Nội dung nghiên cứu
3.1.1- Điều tra tình hình dịch cúm gia cầm trên địa bàn Quảng Ninh các năm 2007-2009. các năm 2007-2009.
3.1.2- Xác định mức độ l−u hành của virus cúmA/ H5N1 (tỷ lệ nhiễm từng loài) trên đàn gia cầm tại Quang Ninh (gia cầm nuôi trong dân, gia cầm nhập lậu, gia cầm l−u thông trên thị tr−ờng).
3.1.3- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của gia cầm đối với vắc xin cúm đ−ợc sử dụng giai đoạn 2007-2009, điều kiện thực địa tại Quảng Ninh. 3.1.4- Đánh giá khả năng xẩy ra dịch cúm gia cầm trên cơ sở giám sát sự l−u hành của virus cúm, đề ra giải pháp phòng chống.
3.2- Đối t−ợng nghiên cứu
- Virus cúm gia cầm trên gia cầm nuôi, nhập lậu, l−u thông.
- Huyết thanh của đàn gia cầm chỉ báo, gia cầm sau tiên phòng, gia cầm nhập lậu, gia cầm l−u thông trên thị tr−ờng.
3.3- Ph−ơng pháp nghiên cứu
- Ph−ơng pháp điều tra, thống kê sinh học.
- Ph−ơng pháp mổ khám với gia cầm ốm chết có các triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm.
- Ph−ơng pháp lấy mẫu xét nghiệm trong phòng thí nghiệm.
- Thực hiện các quy trình chẩn đoán phát hiện virus cúm gia cầm trong các mẫu bệnh phẩm lấy từ Quảng Ninh qua các đợt dịch.
- Làm phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu (HI) để xác định hàm l−ợng kháng thể kháng virus Subtype H5 trong mẫu huyết thanh của gia cầm đ đ−ợc tiêm phòng vắc xin năm 2007-2009.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 24
- Giám sát huyết thanh năm 2007-2009: làm phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu (HI) để phát hiện kháng thể kháng virus Subtype H5 trong huyết thanh gia cầm, thủy cầm không tiêm phòng
- Giám sát l−u hành virus cúm 2007-2009: Làm phản ứng RT-PCR phát hiện virus cúm Subtype H5 trong mẫu dịch ngoáy (Swab).
3.4- Nguyên liệu, dụng cụ và các ph−ơng pháp thí nghiệm
3.4.1- Nguyên liêu, dụng cụ nghiên cứu