2. Tổng quan tài liệu
2.8.2-Tình hình sử dụng vắc xin cúm gia cầm trên thế giới
Việc sử dụng vắc xin cúm trên thế giới hiện nay vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau, có n−ớc không sử dụng biện pháp tiêm phòng, song cũng nhiều n−ớc xây dựng chiến l−ợc phòng chống cúm gia cầm mà việc tiêm phòng cho đàn gia cầm là biện pháp chủ đạo.
* Loại vắc xin đ−ợc phép sử dụng: - Vắc xin cúm vô hoạt.
- Vắc xin tái tổ hợp đậu gà với gen AI H5 nhận từ virus cúm của gà tây [31], [33].
* Tình hình sử dụng vắc xin ở một số n−ớc:
Số l−ợng vắc xin đ−ợc sử dụng ch−a đ−ợc các n−ớc thông báo cụ thể, nh−ng một số nguồn thông tin cho rằng Mexico đ sử dụng 1 tỷ 300 triệu liều vắc xin vô hoạt và 850 triệu liều vắc xin tái tổ hợp đậu gà trong ch−ơng trình chống bệnh cúm từ tháng 01/1995 và đ thanh toán đ−ợc bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao do virus H5N2, mặc dù virus H5N2 chủng độc lực thấp vẫn l−u hành. Indonexia cũng sử dụng vắc xin AI H5 vô hoạt. Từ năm 1995 Pakistan cũng sử dụng vắc xin phòng cúm ở các ổ dịch H7N3 thể độc lực cao. Các vắc xin vô hoạt H9N2 độc lực thấp đ và
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 20
đang đ−ơc sử dụng ở một số n−ớc Châu á, vùng cận đông và Đông Âu. Italia cũng sử dụng vắc xin vô hoạt nhũ dầu H7. Trung Quốc là n−ớc sử dụng vắc xin cúm nhiều nhất với 2 tỷ 830 triệu liều (tính từ tháng 12/2003 đến 4/2005), Trung Quốc có báo cáo về kết quả của 3 loại vắc xin đang sử dụng, bao gồm:
- Vắc xin vô hoạt chủng H5, N-28; đ−ợc phê chuẩn từ tháng 12/2003 và đ−ợc sử dụng rộng ri ở Trung Quốc trong các ổ dịch cúm gia cầm thể độc lực cao vào đầu năm 2004.
- Vắc xin vô hoạt cúm tái tổ hợp (Subtype H5N1, chủng Re 1) đ−ợc phê chuẩn tháng 01/2005. Vắc xin này đ−ợc đánh giá có hiệu lực cao và thời gian bảo hộ kéo dài. Thủy cầm đ−ợc tiêm vắc xin này không bị nhiễm và bài thải virus cúm.
- Vắc xin sống virus đậu tái tổ hợp với cúm gia cầm H5; đ−ợc phê chuẩn 01/2005. Sử dụng vắc xin này có thể phân biệt miễn dịch do tiêm phòng hay miễn dịch thụ động. [28], [27], [30].
2.8.3- Một số chú ý khi sử dụng vắc xin phòng chống virus cúm gia cầm - Khuyến cáo của OIE về việc sử dụng vắc xin phòng chống cúm gia cầm.
Theo quan điểm của OIE, FAO, thì vắc xin nên đ−ợc sử dụng thành một chiến l−ợc toàn diện phòng chống dịch cúm gia cầm, bao gồm 5 công đoạn là: An toàn sinh học, nâng cao nhận thức ng−ời dân, giám sát và chẩn đoán, loại bỏ gia cầm bệnh và sử dụng vắc xin. [ 26].
- Tr−ớc khi sử dụng vắc xin cần chú ý:
+ Vắc xin sử dụng phải cùng Subtype H và thực nghiệm có đủ khả năng bảo hộ chống lại sự xâm nhập virus thực địa.
+ Vắc xin đ−ợc sản xuất theo công nghệ chuẩn hóa để đảm bảo vắc xin hiệu quả và phù hợp về chủng virus.
+ Cần có kế hoạch về phân phối, sử dụng và bảo quản vắc xin.
+ Giám sát huyết thanh học và virus để xác định virus c−ờng độc có l−u hành trong đàn gia cầm đ−ợc dùng vắc xin hay không.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 21
- Ưu điểm của tiêm phòng vắc xin cúm.
+ Giảm đáng kể virus bài xuất trong đàn gia cầm nhiễm bệnh. + Tạo ra sự bảo hộ cho đàn gia cầm.
+ Giảm thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm. - Nh−ợc điểm.
+ Không phù hợp với quy định th−ơng mại quốc tế. Tiêm chủng đ−ợc chấp nhận nh− một biện pháp khống chế dịch cúm gà của OIE.
+ Những đàn gia cầm đ−ợc tiêm phòng không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng bệnh cúm, khó phát hiện dịch và khống chế dịch sớm [12]. 2.9- Tình hình sử dụng vắc xin cúm gia cầm ở Việt Nam
Từ tháng 7/2005. “Dự án sử dụng vắc xin nhằm khống chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm” đ đ−ợc triển khai tiêm phòng trên địa bàn cả n−ớc và thực hiện liên tục qua các năm. Một năm tiêm làm 2 đợt vào tháng 4-5 và tháng 9-10.
Trong giai đoạn I của dự án (2005-2006), đối t−ợng tiêm phòng là gà giống cụ kỵ, ông bà, bố mẹ; trứng gà th−ơng phẩm; gà thịt đ−ợc nuôi từ 70 ngày trở lên; vịt giống, vịt đẻ trứng th−ơng phẩm, gà chọi. Loại vắc xin đ−ợc sử dụng gồm vắc xin chết chủng H5N2 của hng Intervet và của Trung Quốc, tiêm cho gà lần đầu từ 8 ngày tuổi trở lên, tiêm lần 2 cách lần đầu 4 tuần và sau đó 6 tháng sau nhắc lại. Vắc xin chết chủng H5N1 của Trung Quốc, tiêm cho vịt lần đầu từ 15 ngày tuổi trở lên, tiêm lần 2 cách lần đầu 3 tuần và sau 4 tháng tiêm nhắc lại. Năm 2006 sử dụng thêm loại vắc xin sống tái tổ hợp đậu gà- cúm H5 (Vxin trovac của hng Merial) tiêm cho gà con một ngày tuổi ấp nở công nghiệp tr−ớc khi xuất bán.
Giai đoạn II của dự án (2007-2008), đối t−ợng tiêm phòng đ−ợc mở rộng thêm với ngan. Loại vắc xin đ−ợc sử dụng để tiêm: Vắc xin chủng H5N1 của Trung Quốc dùng chung cho gà, vịt; vắc xin H5N2 của Intervet dùng cho gà; vắc xin chết chủng H5N9 của hng Merial (Pháp - Mỹ) dùng cho ngan; vắc xin dùng cho gà con 1 ngày tuổi [3].
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 22
Theo kết quả giám sát huyết thanh học năm 2005-2006 đ đ−ợc công bố, tỷ lệ bảo hộ theo đàn gia cầm sau khi tiêm vắc xin 1-2 tháng đạt mức 53,8-56,2%. Và sau 3-4 tháng đạt mức 33,3-44,9%. Năm 2007 sau khi tiêm vắc xin 1 tháng, tỷ lệ bảo hộ theo đàn đạt mức 72%. Cũng theo các đánh giá cho rằng chiến l−ợc sử dụng vắc xin ở Việt Nam đ đạt đ−ợc kết quả khả quan trong thực tế [11]. Tuy nhiên vẫn cần tiếp tục giám sát sau tiêm phòng, bổ sung, hoàn thiện một số điểm để công tác khống chế, thanh toán bệnh cúm gia cầm thành công.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 23
3. Nội dung, nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1- Nội dung nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.1.1- Điều tra tình hình dịch cúm gia cầm trên địa bàn Quảng Ninh các năm 2007-2009. các năm 2007-2009.
3.1.2- Xác định mức độ l−u hành của virus cúmA/ H5N1 (tỷ lệ nhiễm từng loài) trên đàn gia cầm tại Quang Ninh (gia cầm nuôi trong dân, gia cầm nhập lậu, gia cầm l−u thông trên thị tr−ờng).
3.1.3- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của gia cầm đối với vắc xin cúm đ−ợc sử dụng giai đoạn 2007-2009, điều kiện thực địa tại Quảng Ninh. 3.1.4- Đánh giá khả năng xẩy ra dịch cúm gia cầm trên cơ sở giám sát sự l−u hành của virus cúm, đề ra giải pháp phòng chống.
3.2- Đối t−ợng nghiên cứu
- Virus cúm gia cầm trên gia cầm nuôi, nhập lậu, l−u thông.
- Huyết thanh của đàn gia cầm chỉ báo, gia cầm sau tiên phòng, gia cầm nhập lậu, gia cầm l−u thông trên thị tr−ờng.
3.3- Ph−ơng pháp nghiên cứu
- Ph−ơng pháp điều tra, thống kê sinh học.
- Ph−ơng pháp mổ khám với gia cầm ốm chết có các triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm.
- Ph−ơng pháp lấy mẫu xét nghiệm trong phòng thí nghiệm.
- Thực hiện các quy trình chẩn đoán phát hiện virus cúm gia cầm trong các mẫu bệnh phẩm lấy từ Quảng Ninh qua các đợt dịch.
- Làm phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu (HI) để xác định hàm l−ợng kháng thể kháng virus Subtype H5 trong mẫu huyết thanh của gia cầm đ đ−ợc tiêm phòng vắc xin năm 2007-2009.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 24
- Giám sát huyết thanh năm 2007-2009: làm phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu (HI) để phát hiện kháng thể kháng virus Subtype H5 trong huyết thanh gia cầm, thủy cầm không tiêm phòng
- Giám sát l−u hành virus cúm 2007-2009: Làm phản ứng RT-PCR phát hiện virus cúm Subtype H5 trong mẫu dịch ngoáy (Swab).
3.4- Nguyên liệu, dụng cụ và các ph−ơng pháp thí nghiệm
3.4.1- Nguyên liêu, dụng cụ nghiên cứu
Các nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm là các trang thiết bị và cơ sở vật chất của cơ quan Thú y vùng 2 và Trung tâm Chẩn đoán Thú Y quốc gia. 3.4.2- Ph−ơng pháp lấy, xử lý mẫu
Với gia cầm, thủy cầm và động vật có vú còn sống lấy mẫu bệnh phẩm là dịch ngoáy mũi , ngoáy họng, khí quản, dịch ngoáy ổ nhớp, mẫu phân, máu.
Với gia cầm, thủy cầm đ chết, lấy mẫu là khí quản, dịch khí quản, dịch rửa phế nang, phổi, các tổ chức phủ tạng khác: No, gan, lách, thận, tuyến tụy... lấy mẫu phải lấy đúng lúc, đúng kỹ thuật. Các mẫu dùng để phân lập virus tốt nhất đ−ợc lấy trong vòng 3 ngày đầu sau khi gia cầm có biểu hiện triệu chứng bệnh cúm.
Mẫu đ−ợc giữ ở nhiệt độ 40C và xét nghiệm ngay trong vòng 48h. Nếu cần bảo quản thời gian dài hơn thì giữ ở -700C.
a) Xử lý bệnh phẩm.
- Bệnh phẩm là dịch ngoáy khí quản, hậu môn và phân.
- Bệnh phẩm đ−ợc làm ấm, thêm kháng sinh, lắc trộn đều để nhiệt độ phòng 30 phút, dịch ngoáy hậu môn và phân có thể lọc qua màng lọc sau đó dùng để tiêm truyền.
b) Bệnh phẩm là tổ chức.
Tiến hành nghiền mẫu dịch phẩm là tổ chức trong PBS PH 7,2 thành huyền dịch 10%. Ly tâm huyền dịch 1000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. Bổ sung kháng sinh 10x (đặc 10 lần) gồm kanamycin,
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 25
penecillin, streptomycin theo tỷ lệ 1/10 vào huyền dịch bệnh phẩm trên, để trong tủ lạnh 40C ít nhất trong vòng 2h để kháng sinh diệt các tạp khuẩn. Huyền dịch bệnh phẩm đ xử lý, nếu ch−a dùng phân lập ngay thì bảo quản ở -700C.
c) Bệnh phẩm là máu.
Máu gia cầm đ−ợc đựng trong ống ly tâm nhỏ, ly tâm với tốc độ 1500 vòng trong 5 phút để tách riêng huyết thanh. Dùng pipette hút huyết thanh ở trên đ−a sang ống khác. Huyết thanh này bảo quản ở 40C đ−ợc dùng trong phản ứng HI, sau đó có thể l−u giữ ở -300C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.3- Ph−ơng pháp xác định kháng nguyên 3.4.3.1- Phân lập virus trên trứng có phôi 3.4.3.1- Phân lập virus trên trứng có phôi
- Chọn trứng có phôi 9-10 ngày tuổi khoẻ mạnh, 3-5 trứng/bệnh phẩm.
- Lau trứng bằng cồn 700 và đục lỗ nhỏ phía trên buồng hơi.
- Dùng syringe 1ml hút dịch bệnh phẩm tiêm vào xoang niệu mô với l−ợng 0,2ml/ trứng.
- Gắn vết tiêm bằng keo dán, ấp trứng 2-3 ngày ở nhiệt độ 370C. - Theo dõi sau khi tiêm, ngày 02 lần soi trứng, trứng chết đ−ợc cất vào tủ lạnh 40C để kiểm tra. Sau thời gian ấp, trứng chết hoặc sống đ−ợc cất vào tủ lạnh 40C qua đêm hoặc ít nhất 4h tr−ớc khi thu hoạch.
- Thu hoạch dịch niệu mô vào ống nghiệm thu riêng trứng chết và trứng sống.
3.4.3.2- Kiểm tra n−ớc trứng bằng phản ứng HA
- Nhỏ 25 àl PBS 0,01M vào đĩa 96 giống chữ V từ giếng 1 đến giếng 12 của mỗi hàng.
- Cho 25 àl dịch niệu mô vào giếng 1 trộn đều.
- Pha long kháng nguyên bằng cách chuyển 25àl dịch niệu mô từ giếng 1 sang giếng thứ 2, tuần tự đến giếng thứ 11 thì bỏ đi 25àl.
- Nhỏ thêm 25 àl PBS vào các giếng.
- Nhỏ 25 àl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng trên. - Lắc đĩa bằng máy hoặc bằng tay.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 26
- ủ đĩa ở nhiệt độ phòng, thời gian 40 phút. - Đọc kết quả:
+ Phản ứng d−ơng tính, hồng cầu ng−ng kết thành hạt lấm tấm. + Phản ứng âm tính hồng cầu lắng xuống đáy thành cục màu đỏ. Hiệu giá HA vủa virus đ−ợc tính ở độ pha long kháng nguyên cao nhất còn hiện t−ợng ng−ng kết hồng cầu. Ví dụ: Nếu ở độ pha long 1/64 còn có ng−ng kết thì hiệu giá HA là 1/64.
- Nếu HA d−ơng tính, chứng tỏ có virus. Tiếp tục giám định bằng phản ứng HI với kháng huyết thanh chuẩn của một Subtype H virus cúm A và kháng huyết thanh chuẩn Newcastle để xác định loại virus phân lập.
- Nếu HA âm tính mà phôi chết, có bệnh tích phôi thì phải lấy n−ớc trứng tiêm truyền lần 2.
- Nếu HA âm tính mà phôi phát triển bình th−ờng, không cần làm lại. 3.4.3.3- Giám định virus phân lập bằng phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu HI
Pha kháng nguyên 4 HA/25àl: Lấy độ pha long cuối cùng có phản ứng ng−ng kết hồng cầu 1 HA nhân với 4.
Ví dụ: Hiệu giá HA của dịch niệu mô là 1/64 đơn vị 4HA= 1/64 x 4 = 1/16
Nh− vậy trộn 1 phần n−ớc trứng với 15 phần PBS để đạt đ−ợc dung dịch kháng nguyên 4HA.
- Chuẩn độ kháng nguyên 4HA:
Sau khi pha kháng nguyên 4HA phải đ−ợc chuẩn độ lại. Tiến hành nh− phản ứng xác định hiệu giá HA.
+ Pha chuẩn: Ng−ng kết xẩy ra ở 2 giếng đầu.
+ Pha không chuẩn: Nếu ng−ng kết đến giếng thứ 3 tức là thừa kháng nguyên. Nh− vậy hỗn dịch kháng nguyên có 8HA phải đ−ợc pha long (có thể gấp đôi) để có ng−ng kết đến giếng thứ 2. Kháng nguyên long ng−ng kết chỉ ở giếng 1 tức là thiếu kháng nguyên có thể thêm 01
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 27
l−ợng kháng nguyên bằng với l−ợng kháng nguyên ban đầu để có ng−ng kết ở giếng thứ 2.
- Tiến hành phản ứng HI
+ Nhỏ 25àl PBS vào các giếng của đĩa 96 giếng chữ V từ thứ 01 đến 12. + Nhỏ tiếp 25àl kháng huyết thanh vào giếng đầu tiên trộn đều. + Pha long kháng huyết thanh theo cơ số 02, bằng cách chuyển 25àl kháng huyết thanh từ giếng 01 sang giếng 02 và tuần tự đến giếng 11 thì bỏ đi 25àl.
+ Nhỏ 25àl kháng nguyên 4HA vào các giếng từ 01 đến 11. Thêm 25àl PBS vào đối chứng hồng cầu (giếng 12). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Lắc đĩa và ủ nhiệt độ phòng 30 phút.
+ Nhỏ 25àl dung dịch hồng cầu vào tất cả các giếng của đĩa lắc đều. + Để nhiệt độ phòng 40 phút.
(Trên 01 đĩa có thể tiến hành nhiểu phản ứng HI với nhiều mẫu kháng huyết thanh của các Subtype khác nhau).
- Đọc kết quả:
+ Phản ứng d−ơng tính: Hồng cầu lắng xuống đáy. Nh− vậy virus phân lập và kháng huyết thanh chuẩn t−ơng ứng với nhau.
+ Xác định Subtype: Một virus phân lập đ−ợc xác định Subtype khi phản ứng với một kháng huyết thanh chuẩn với hiệu giá cao hơn 4 lần so với các kháng huyết thanh chuẩn khác. Hiệu giá càng cao chứng tỏ sự t−ơng đồng virus phân lập với kháng huyết thanh chuẩn càng lớn.
3.4.3.4- Ph−ơng pháp RT/PCR
a) Chiết tách ARN từ mẫu dịch ngoáy (Swab) dùng kít Qiagen (R) Rneasy.
- Lắc mạnh bằng máy ống chứa dịch ngoáy và chuyển l−ợng 500àl sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫu. Cho 500àl Qiagen (R) buffer RLT có β-ME vào ống ly tâm trên. Lắc đều bằng máy Vontex.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 28
- Ly tâm (bằng máy Spin dwn) để dịch bệnh phẩm đọng trên nắp trôi xuống đáy. Cho 500àl cồn ete, lắc mạnh bằng Vontex, ly tâm mẫu đ