IV. CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM
3giá trị trung bình phân tích thống kê được biến đổi bằng (y 0,26 ), trình bày dữ liệu gốc.
bày dữ liệu gốc.
a. Sự khác nhau về hàm lượng isoflavone giữa IAS 5 và BR- 36 được giữ lại trong sữa đậu nành và đậu nành nấu nguyên hạt bất kể phương pháp chế biến.
b. Aglucone genistein được tạo thành trong sữa đậu nành giảm về lượng và không ảnh hưởng đến mùi vị. Xử lý đậu bằng cách ngâm nước trước làm tăng mùi vị đậu trong sữa đậu nành và làm giảm sự nhận biết tính chất làm se, điều này gây ra bởi genistein.
c. Khi đậu nành nguyên hạt nấu dưới áp suất, malony glucoside bị biến đổi thành các glucoside kết hợp (daidzin và genistin). Trong trường hợp này, các aglucone (daidzein và genistein) không tạo thành và không nhận thấy sự khác nhau về tính chất làm se,
d. Mùi vị đậu nành liên quan đến nhiều hợp chất phức tạp khác nhau và gia nhiệt trước là một phương pháp hiệu quả để giữ cho các sản phẩm từ đậu nành có mùi vị tốt hơn.
2. Đặc tính isoflavone và hoạt tính chống oxy hóa của đậu nành Ohio:
2.1. Tóm tắt:
Mười bảy loại đậu nành Ohio được lọc để tách hàm lượng isoflavone và hoạt tính chống oxy hóa. Hàm lượng isoflavone được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp với pha tĩnh là C18 kết hợp với một máy dò photodiode. Hoạt tính chống oxy hóa cuả dịch chiết đậu nành được đo bằng gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH) và phương pháp phát quang bằng phương pháp hóa học PCL. Tổng hàm lượng isoflavone nằm trong khoảng 4,20÷11,75µmol/g đậu nành, trung bình là 7,12µmol/g đậu nành. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết đậu nành nằm trong khoảng 7,51÷12,18µmol đương lượng butyl hydroxyltoluen (BHT)/g đậu nành, sử dụng phương pháp DPPH. Độ tan của chất chống oxy hóa trong chất béo nằm trong khoảng từ 2,40 đến 4,44µmol đương lượng trolox/g đậu nành và trong nước là 174,24 đến 430,86µmol đương lượng acid ascorbic/g đậu nành, sử dụng phương pháp PCL.
2.2. Giới thiệu:
Mức độ tiêu thụ đậu nành và các sản phẩm từ đậu nành liên quan đến khả năng làm giảm một số loại ung thư như ung thư vú, tuyến tiền liệt… Hoạt tính tăng cường sức khỏe của đậu nành một phần là do sự có mặt của isoflavone. Các nhà nghiên cứu cho rằng tác dụng có lợi cho sức khỏe của đậu nành là do hoạt tính estrogen của isoflavone hay hoạt tính chống oxy hóa. Do cấu trúc của
isoflavone tương tự như estrogen nên có khả năng sửa chữa những hormone gây ung thư.
So với chế độ ăn uống Châu Á, chế độ ăn uống ở Phương Tây thiếu ưa chuộng những thức ăn có hàm lượng đậu nành cao như đậu phụ, miso, natto, và đậu nành nguyên hạt. Một chiến lược làm tăng việc sử dụng đậu nành ở các nhước phương Tây là kết hợp những thành phần có trong đậu nành với những sản phẩm truyền thống của họ. Việc chọn những giống đậu có hàm lượng isoflavone cao hay những hợp chất tăng cường sức khỏe khác như chất chống oxy hóa sẽ làm tăng ảnh hưởng có lợi cho sức khỏe của sản phẩm thực phẩm.
Hàm lượng isoflavone trong đậu nành và các sản phẩm từ đậu nành nằm trong khoảng từ 1µg/g trong nước tương đến 540µg/g trong tempeh, sữa đậu nành và đậu phụ chứa hàm lượng isoflavone cao nhất. Isoflavone tìm thấy trong đậu nành ở dưới dạng aglycone, β-glucoside, 6-O”-malony-β- glucoside, hay 6-O”-acetyl-β-glucoside. Trong đậu nành tươi, isoflavone hầu hết ở dạng glucoside và một phần nhỏ ở dạng aglucone. Hàm lượng isoflavone trong đậu nành phụ thuộc vào nhiều nhân tố như giống, thời điểm thu hoạch, nơi trồng, bảo quản và tương tác giữa giống với môi trường.
Những tính chất của chất chống oxy hóa, đặc biệt là hoạt tính làm sạch thì rất quan trọng vì có vai trò xóa bỏ gốc tự do trong thực phẩm và trong hệ thống sinh học. Sự tạo thành quá mức của những gốc tự do đã xúc tác các phản ứng oxy hóa trong thực phẩm và làm giảm chất lượng thực phẩm và mức độ tiệu thụ. Các gốc tự do cũng liên quan đến quá trình chín và những bệnh liên quan đến tuổi. Anion chứa nhiều oxy là một dạng yếu của phân tử oxy, tham gia vào giai đoạn đầu của phản ứng oxy hóa có liên quan đến sự chín. Anion chứa nhiều oxy đóng vai trò quan trong trong sự hình thành của các dạng oxy phản ứng như hydrogen peroxide, gốc hydroxyl, oxy nguyên tử gây ra sự oxy hóa lipid, protein và DNA.
Trong nghiên cứu này, hoạt tính chống oxy hóa của đậu nành được xác định bằng phương pháp DPPH và phương pháp PCL. DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá tác dụng loại bỏ gốc tự do của một số loại flavonoid và polyphenol trong hệ thống thực phẩm. Phương pháp PCL đo độ phát quang từ độ sáng, một máy nhạy cảm với ánh sáng phát ra anion nhiều oxy khi chiếu tia UV. Những chất chống bức xạ phản ứng với anion giàu oxy và độ phát quang còn lại được xác định. Phương pháp PCL được
dùng để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trong đồ uống và thảo dược như cây ngải đắng, oregano, cây anh thảo. PCL có độ nhạy gấp 100 – 1000 lần phương pháp hóa học truyền thống sử dụng hợp chất anion.
Đậu nành là một trong những cây trồng quan trọng ở Ohio và là một loại ngũ cốc được trồng nhiều nhất. Tuy nhiên, hệ thống đặc tính của hàm lượng isoflavone và hoạt tính chống oxy hóa của những giống đậu nành ở Ohio thì vẫn chưa được nghiên cứu.
Mục đích của nghiên cứu này là tách hàm lượng isoflavone và hoạt tính chống oxy hóa của 17 loại đậu nành ở Ohio và qua đó xác định giống đậu nành chứa hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa cao nhất dùng để đưa vào thành phần thức ăn của những thực phẩm chức năng chế biến từ đậu nành.
2.3. Nguyên liệu và phương pháp:
Nguyên liệu :
17 giống đậu nành và những dạng đưa vào thí nghiệm, gồm có Ohio FG1, Ohio FG3, Ohio FG4, Ohio FG5, HS96-3145, HS96-3850, HF01-0019, HSO-3274, HF9667-2-4, HF9662-2-15, HF99- 019, HF02-0218, HC95-1503, HS93-4118, dilworth, dwight và Pana, thu được từ khu trồng rau quả của trường đại học Ohio. Hầu hết các giống đậu nành được phát triển ở trung tâm nghiên cứu và phát triển nông nghiệp Ohio (OARDC) của trường đại học Ohio, trồng và thu hoạch năm 2002 ở những vùng khác nhau ở Ohio. Những giống này được chọn để đại diện tính đa dạng cho nguyên liệu thực phẩm và hạt. Giống, loại và khu vực trồng trình bày ở bảng V.6. 12 loại isoflavone tiêu chuẩn gồm daidzein, glycitein, genistein, daizin, glycitin, genistin, malonyl daidzin, malonyl glycitin, malonyl genistin, acetyl daidzin, acetyl glycitin và acetyl genistin, thu được từ LC Laboratories (Woburn. MA), DPPH, butyl hydroxyltoluen (BHT) và formononetin thu được từ Aldrich (St. Louis, MO). Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) xếp loại (grade) methanol, acetonitrile, HCl và acid acetic thu được từ Fisher Scientific (Fairlawn, NJ).
Bảng V.6: Giống, loại và khu vực trồng của 17 loại đậu
nành dùng để nghiên cứu
Loại Giống Dạng Khu vực
trồng Dilworth Dwight HC95 – 1503 HF01 – 0019 HF02 – 0218 HF9667 – 2 – 15 Chapman × Probst Jack × A86 – 303014 DPL 3478 – Sprite 87 HF92 – 080 × HS93 – 6169 ORC 9508 × IA 2016 Hạt bột Hạt bột Hạt bột Thực phẩm Thực Hytville, OH Hytville, OH Cygnet, OH Wooster, OH Hytville, OH Crotton, OH
HF9667 – 2 – 4 HF99 – 019 HS93 – 4118 HS96 – 3145 HS96 – 3850 Ohio – FG4 Ohio – FG5 HS0 – 3247 Ohio – FG13 Ohio – FG3 Pana General × GXR 9648 General × GXR 9648 IA 2022 × Archer IA 2007 × DSR 304 HS89 – 8843 × Ohio FG1 HS89 – 2966 × HS89 – 8843 Ohio FG1 × HS89 – 3078 Ohio FG1 × HS89 – 3078 HS93 – 4118 × Savoy LS301 × HS84 – 6247 HS89 – 8843 × Ohio FG1
Jack × Asgrow A3205
phẩm Hạt bột Hạt bột Hạt bột Hạt bột Thực phẩm Thực phẩm Thực phẩm Thực phẩm Hạt bột Thực phẩm Thực phẩm Hạt bột Crotton, OH Hytville, OH Hytville, OH Wooster, OH Wooster, OH Wooster, OH Wooster, OH Hytville, OH Hytville, OH Hytville, OH Hytville, OH Chuẩn bị bột đậu nành :
Đậu nành được tách vỏ và nghiền bằng máy nghiền cắt (Black và Decker, Trumbull, CO) để làm bột đậu nành với kích thước nhỏ hơn 0,1cm chiều dài. Thức ăn từ đậu nành đuợc bảo quản ở -20OC đến khi sử dụng.
Phân tích Isoflavone: chiết isoflavone, bột đậu nành (0,5g) mỗi loại giống được trộn với 2ml dung dịch 100mmol HCl, 7ml acetonitril và 3ml nước đã loại ion trong bình ly tâm (công ty Nalge, các nhà nghiên cứu, NY). Các bình mẫu được khuấy và được lắc với máy lắc tay ở chế độ 9 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng trước khi ly tâm với tốc độ 4500 vòng/phút trong 30 phút. Lấy 1ml dung dịch ở lớp trên cho vào bình thủy tinh 10 ml và sấy khô, thổi khí nitơ ở nhiệt độ phòng. Mẫu đã sấy khô được giữ ở -20OC trong tối cho đến khi sử dụng. Mỗi giống được chiết nhiều lần. Mức độ tin cậy của phương pháp chiết được đánh giá bằng cách chiết sau khi thêm vào một lượng formononetin nồng độ xác định vào các giống đậu HF99-019, HF01-0019, Dwight theo tiêu chuẩn quốc tế và glycitein trong 80% MeOH vào giống đậu HS93-4118, Ohio FG4 và Ohio FG3 rồi xác định lượng formononetin và glycitein giữ lại. Phần trăm formononetin giữ lại là 98,3 ± 5,3 và glycitein là 97,4 ± 5,9%.
Phân tích HPLC : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thiết bị HPLC 2690 với đầu dò photodiode 2996 được dùng để tách, xác định và định lượng isoflavone. Tách isoflavone bằng cách sử dụng một cột pha động C18 (150mm
x 3,9mm I.D.) và một cột pha động C18 và một máy lọc 0,5
µm. Dùng 1ml ethanol 100% hòa tan lại mẫu châm mẫu. Hỗn hợp này được khuấy và lọc qua máy lọc 0,2µm trước khi châm mẫu vào máy HPLC. Pha động gồm 1%(v/v) dung dịch acid acetic (pha động A) và acetonitrile 100% (pha động B) chảy với tốc độ là 0,6 ml/phút. Lượng mẫu châm vào là 10µm và thành phần được tách rửa ở chế độ: từ 0 đến 5 phút, pha động A là 85%; từ 5 đến phút 44, pha động A giảm từ 85% đến 65%; từ phút 44 đến phút 45, pha động A tăng từ 65% đến 85%, cuối cùng pha động A ở 85% trong 5 phút. Giữa mỗi lần châm, hỗn hợp 85% pha động A và 15% pha động B được chạy trong 20 phút. Quang phổ thu được trong khoảng 240 đến 400 bằng PDA, và các hợp chất trong quá trình tách rửa được thu ở bước sóng 260nm.
Hình V.1: Sắc ký đồ của isoflavone thu nhận từ thiết
bị HPLC
Xác định isoflavone :
12 loại isoflavone được xác định dựa vào thời gian lưu trong sắc ký HPLC và quang phổ UV của những hợp chất isoflavone chuẩn.
Định lượng isoflavone :
Lấy khoảng 1mg tinh thể chuẩn của daidzein, glycitein, genistein, daizin, glycitin, genistin, malonyl daidzin, malonyl glycitin, malonyl genistin, acetyl daidzin, acetyl glycitin và acetyl genistin hòa tan trong 100ml dung dịch ethnol 80% làm dung dịch gốc. Dung dịch gốc được đặt trong tủ lạnh một đêm để isoflavone tan hoàn toàn. Mỗi dung dịch gốc isoflavone được pha loãng bằng dung dịch ethanol 80%. Nồng độ của dung dịch làm việc được xác định dựa vào định luật Beer-Lambert với độ hấp thu UV đọc trong khoảng 240-360nm và hệ số phân hủy phân tử trong ethenol 80% được xác định bằng
máy đo quang phổ UV-vis. Mỗi dung dịch isoflavone chuẩn châm vào máy HPLC để xác định các peak. Mối liên quan giữa các peak HPLC và nồng độ của isoflavone thu được từ máy đo quang phổ UV-vis được tính toán và sử dụng để định lượng isoflavone. Nồng độ của malonyl glycitin tính dựa vào acetyl glycitin chuẩn. Hàm lượng isoflavone trong nghiên cứu này tính theo µmol/ g đậu nành. Hệ số tương quan (r) của tất cả các đường cong chuẩn của các isoflavone chuẩn lớn hơn 0,99.
Hoạt tính chống oxy hóa :
+ Phương pháp DPPH:
Hoạt tính loại bỏ các gốc tự do của các giống đậu nành được xác định dựa vào một sự thay đổi của Ozcelik và các cộng sự. Phương pháp DPPH được dùng để đo hoạt tính chống oxy hóa của thực phẩm. Dịch chiết mẫu đã sấy khô được hòa tan lại với 1ml methenol 100% đến một nồng độ là 0,5mM. Lấy 3,75ml dung dịch DPPH 0,5mM trên trộn với 0,25ml mẫu chiết trong methanol. Sự thay đổi độ hấp thu của hỗn hợp DPPH được đo ở 30 phút với bước sóng 517nm.
Hoạt tính loại bỏ gốc tự do của các mẫu biểu diễn bằng một đương lượng BHT, một hợp chất hay sử dụng trong thực phẩm. Một đường cong chuẩn của hoạt tính loại bỏ của BHT theo phương pháp DPPH xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 517nm ở phút 30 của 3,75ml dung dịch DPPH 0,5mM trộn với 0,25ml dung dịch BHT trong methanol 100% 0,05; 0,075; 0,1; 0,25; 0,5mM. Hoạt tính loại bỏ gốc tự do của các giống đậu nành được tính theo đương lượng BHT. Tăng đương lượng BHT sử dụng sẽ hạn chế tối thiểu ảnh hưởng của điều kiện phân tích như tỷ lệ DPPH và mẫu hay nồng độ DPPH.
+ Phương pháp PCL:
Phương pháp PCl dùng hệ thống quang hóa để đo hoạt tính chống oxy hóa, đặc biệt là hoạt tính loại bỏ các anion giàu oxy của dịch chiết đậu nành. Phương pháp này để kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa của hệ sinh học. Mẫu chiết được hòa tan lại trong 1ml methanol 100% và lọc qua đĩa lọc 0,2µm. Hoạt tính chống oxy hóa của những mẫu này được đo bằng dụng dụ ACL và ACW, cách thực hiện được mô tả bởi nhà sản xuất. ACL là dụng cụ đo hoạt tính chống oxy hóa của lipid và biểu diễn bằng đương lượng trolox/g đậu nành. ACW đo hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất tan trong nước, biểu diễn bằng đương lượng của acid ascorbic/g đậu nành.
Phân tích isoflavone từng giống lặp lại 4 lần. Tất cả các phân tích chống oxy hóa lặp lại 2 hay 3 lần. Số liệu được phân tích thống kê bằng phân tích phương sai và t-Test sử dụng StarView.
2.4. Kết quả và thảo luận:
Phân tích isoflavone trong các giống đậu nành :
Một sắc ký HPLC tiêu biểu cho isoflavone của đậu này được biểu diễn ở hình V.1. Sai số trung bình của 12 loại isoflavone của mỗi giống đậu nành là nhỏ hơn 5% (n = 4).
Hàm lượng isoflavone của 17 giống đậu nành được trồng ở Ohio biểu diễn ở bảng V.7. Hàm lượng isoflavone khác nhau về aglycone và glucoside, tổng lượng daidzein, genistein, glicitein, isoflavone (P< 0,05). Tổng hàm lượng isoflavone cao nhất là 11,75µmol/g đậu nành thu được từ giống HF99-019, thấp nhất từ gống HF9667-2-4 và hàm lượng trung bình là 7,12µmol/g đậu nành. Wang và Murphy cho rằng loại gen và thời điểm trồng ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng isoflavone trong đậu nành hơn nơi trồng. Dựa vào kết quả nghiên cứu trên, giống HF99-019, Dwight, HS93-4118 và Ohio FG1 được cho là những giống có hàm lượng isoflavone cao nhất. Nếu những giống đậu nành xác định được trồng cùng một nơi và trong cùng điều kiện thì ảnh hưởng của nơi trồng đến hàm lượng isoflavone là thấp nhất.
Hoạt tính chống oxy hóa :
+ Phương pháp DPPH:
Hoạt tính chống oxy hóa của 17 giống đậu nành được biểu diễn trong bảng V.7. Giống Dwight là giống có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất với 12,18µmol đương lượng BHT/g đậu nành và giống Dilworth là giống có hoạt tính chống oxy hóa thấp nhất với 7,51µmol đương lượng BHT/g đậu nành, trong khi hoạt tính loại bỏ gốc tự do trung bình của 17 loại đậu là 10,13µmol đương lượng BHT/g đậu nành.
Hoạt tính loại bỏ gốc tự do của dịch chiết từ đậu nành và các sản phẩm từ đậu nành theo phương pháp DPPH được tính dựa trên tỷ lệ phần trăm gốc tự do bị ức chế hay khối lượng hạt làm giảm 50% độ hấp thu ở bước sóng 520nm. Dịch chiết đậu nành được phát hiện là có hoạt tính loại bỏ gốc tự do, hoạt tính này phụ thuộc vào giống và môi trường. Những sản phẩm chế biến từ đậu nành như đậu phụ có khoảng 50% hoạt tính loại bỏ các gốc tự do so với đậu nành tươi, điều này chứng tỏ phương