3.1.1. Hĩa chất:
- Carbaryl_ Đơ tinh khiết > 98% - Dimethoate_ Độ tinh khiết > 98% - Axeton_Trung Quốc
- NaCl_Trung Quốc
- Axetonitril_Merk_HPLC - Methanol_Merk_HPLC - H3PO4
- Acid ascorbic_Trung Quốc - KH2PO4
- Nước cất 2 lần
Dung dịch chuẩn gốc Carbaryl, Dimethoate: Cân chính xác lượng 0,1000 g mỗi chất, hịa tan trong Axetonitril và định mức lên 100 ml bằng Axetonitril thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 1000 ppm, bảo quản trong tủ lạnh để sử dụng cho các thí nghiệm.
Dung dịch chuẩn gốc Vitamin C 1000 ppm mỗi lần thí nghiệm sẽ được pha mới. Cân 0,1000 g Acid ascorbic định mức lên 100 ml bằng dung dịch đệm KH2PO4 pH= 2,8.
3.1.2. Thiết bị:
- Máy sắc ký lỏng_ hãng Shimazdu SPD – 6AV_ Đầu dị UV – VIS - Bể đánh siêu âm_ Decon
- Máy cơ đặc chân khơng_ Heidolph WB 2000 - Máy đo quang phổ vùng UV – VIS.
- Máy xay sinh tố Gali - Máy khuấy từ
- Phiễu chiết 250 ml
- Màng lọc 0,45 µm, giấy lọc 0,6 µm - Bình định mức 10, 25, 50, 100 ml - Ống đong 100, 500 ml
3.2. Khảo sát phổ hấp thu UV-VIS Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C.
Chuẩn bị các dung dịch Carbaryl, Dimethoate trong nước và dung dịch Vitamin C trong đệm pH = 2,8 với nồng độ khoảng 3ppm. Sử dụng cuvet thạch anh để đo. Tiến hành quét phổ bằng máy quét phổ tự động cĩ bước sĩng từ 200 nm đến 350 nm. Ghi nhận số liệu đo được và vẽ các đồ thị biểu diễn phổ hấp thu vùng UV của 3 chất trên.
Dựa vào đồ thị phổ thu được chọn bước sĩng hấp thu cực đại cho mỗi chất. Sau đĩ đặt bước sĩng cho máy HPLC tương ứng khi phân tích từng chất trên.
3.3. Thiết lập các thơng số cho hệ thống HPLC
Luận văn này sử dụng hệ thống máy sắc ký lỏng của hãng Shimazdu: đầu dị UV- VIS SPD – 6AV, bơm LC – 10AS, máy ghi sắc ký đồ C – R6A.Cột phân tích Gemini pha đảo C18: 250 x 4,6 mm x 5 µm x 110 Ao.
Các thơng số chính của hệ thống:
- Đặt giá trị áp suất cực đại (P.MAX): 300 kgf/cm2. Mục đích là để bảo vệ cột và các hệ thống khác, khi áp suất vượt P.MAX bơm sẽ tự động tắt.
- Đặt giới hạn dưới của áp suất (P.MIN): thường là 0. Mục đích là khơng cho khơng khí vào hệ thống khi cĩ sự cố hở trên hệ thống và an tồn khi đo.
- Aùp suất đạt được khi hệ thống ổn định: 98 – 110kgf/cm2 - Tốc độ dịng pha động 1ml/phút
- Thể tích bơm mẫu 20 µl.
- Atten: cĩ giá trị từ 0 đến 10, giá trị càng nhỏ thì khoảng biểu diễn trên sắc ký đồ càng nhỏ, dùng atten nhỏ khi đo nồng độ thấp mà khơng ảnh hưởng tới diện tích peak đo được, thường sử dụng atten =10.
- Speed (tốc độ giấy): thường dùng là 5, muốn peak sắc nhọn thì giảm Speed - Bước sĩng của đầu dị: - Đối với Carbaryl: 220 nm
- Đối với Dimethoate: 204 nm - Đối với Vitamin C: 245 nm
3.4. Khảo sát thành phần pha động phân tích hai chất Carbaryl và Dimethoate.
Từ dung dịch chuẩn gốc Carbaryl và Dimethoate 1000 ppm pha sẵn, tiến hành pha lỗng bằng nước được dung dịch cĩ nồng độ10 ppm của Carbaryl và Dimethoate trong nước.
Chuẩn bị pha động khảo sát: ở đây chúng ta tiến hành khảo sát khả năng tách Carbaryl và Dimethoate của các pha động cĩ thành phần Axetonitril và nước theo những tỉ lệ 85/15, 70/30, 55/45, 40/60.
Tiến hành pha các pha động với tỉ lệ về thể tích Axetonitril: nước = 85/15, 70/30, 55/45, 40/60. Ứng với mỗi pha động này ta thực hiện phân tích cho cả Carbaryl và Dimethoate ở nồng độ 10 ppm đã pha ở trên. Mỗi pha động khi phân tích với từng chất sẽ cho số liệu về thời gian lưu và diện tích peak tương ứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.5. Xây dựng các đường chuẩn của các chất phân tích
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C với các nồng độ 1, 2, 5, 10, 20 ppm bằng cách pha lỗng ra từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm.
Pha động chọn để xây dựng đường chuẩn dựa vào kết quả của thí nghiệm mục 3.4. Đối với Carbaryl và Dimethoate chọn pha động là Axetonitril: nước theo tỉ lệ thể tích 55: 45. Cịn đối với pha động phân tích Vitamin C sử dụng là methanol: hệ đệm KH2PO4 cĩ pH = 2,8 theo thể tích 10 : 90.
Hệ đệm được pha bằng cách hồ tan 6,5g KH2PO4 trong 1l nước cất 2 lần, chỉnh pH về 2,8 bằng H3PO4 rồi lọc bằng màng 0,45µm.
Tiến hành đo các dung dịch Carbaryl và Dimethoate trên máy sắc ký với các thơng số như mục 3.3 trên. Mỗi mẫu chuẩn phân tích 3 lần, lấy giá trị trung bình của diện tích peak. Thiết lập đường chuẩn phụ thuộc của diện tích peak thu được vào nồng độ chất phân tích trong dung dịch mẫu chuẩn.
3.6. Xác định độ thu hồi mẫu qua cột của mỗi chất ứng với điều kiện chọn phântích. tích.
Để xác định độ thu hồi mẫu cùa các chất qua cột phân tích ta tiến hành phân tích ớ các nồng độ từ 1 đến 20 ppm.
Ở chế độ cĩ đi qua cột: mỗi nồng độ phân tích 3 lần theo chế độ ứng với chất đã nêu ở trên, tính diện tích peak trung bình (Xc).
Ở chế độ khơng cho qua cột: cứ khoảng 1 phút ta tiêm mẫu vào cột một lần với thể tích 20 µl, sau 5 -6 phút thì dừng (các lần bơm từ lần 2 trở đi khơng nhấn phím START). Tính giá trị trung bình của diện tích peak ở mỗi nồng độ (X0).
Giá trị hiệu suất thu hồi qua cột Hc(%) được tính theo cơng thức: Hc(%) = X Xc 0 100 [Cơng thức 1]
3.7. Khảo sát các bậc trích ly Carbaryl, Dimethoate và xác định hiệu suất thu hồi qua các bậc.
3.7.1. Lựa chọn quy trình trích ly đối với Carbaryl và Dimethoate.
Tài liệu tham khảo từ AOAC và các luận văn tốt nghiệp đại học năm trước cho thấy, quy trình phân tích dựa trên các bước cơ bản: trích ly, làm sạch, phân tích trên thiết bị. Trong quy trình trích ly các chất Carbaryl và Dimethoate thì quan trọng nhất phải chọn được dung mơi trích ly tốt nhất. Ở đây chúng tơi chọn dung mơi trích ly là Axeton. Các bước tiến hành của qúa trình trích ly Carbaryl và Dimethoate được thực hiện như sau:
- Bước 1: Cân 100g mẫu rau cho vào máy xay Magic bullet, thêm 200 ml Aceton vào, nghiền trong thời gian 1 phút.
- Bước 2: Chuyển hỗn hợp sau khi nghiền vào trong bercher 500 ml, tráng sạch máy xay bằng Axeton, sau đĩ đem đi khuấy từ trong thời gian 15 phút
- Bước 3: Tiến hành lọc chân khơng qua giấy lọc trên phễu lọc Buchner, thu dịch lọc vào Bercher 500 ml. Bã giữ lại ở trên phễu. Cân khoảng 20g muối NaCl (tùy vào lượng nước cĩ trong mẫu) cho vào dịch trích, khuấy cá từ để hịa tan hồn tồn muối
- Bước 4: Chuyển dịch đã bổ sung muối vào trong phiễu chiết, tách pha hữu cơ ra khỏi pha nước.
- Bước 5:Lấy pha hữu cơ phía trên đem đi cơ quay chân khơng cho đến khi cạn và dịch khơng cịn thay đổi thể tích nữa thì dừng.
- Bước 6: Chuyển phần dịch sau cơ quay vào bình định mức 100 ml, tráng bình cơ quay bằng 25 ml Axetonitril vào bình định mức tiếp tục định mức đến vạch.
- Bước 7: Dịch sau khi định mức đem đi lọc với màng lọc 0,45 µm sau đĩ đánh siêu âm loại bọt khí và tiến hành phân tích trên máy HPLC.
Hình 3.1:Sơ đồ quy trình trích ly Carbaryl và Dimethoate.
Cơ quay chân khơng 120 v/p,45oC Tráng bình Tách pha Pha nước 20 g NaCL 100g rau Xay 200 ml Axeton Lắc Lọc chân khơng Bã Siêu lọc 0,45 µm Dịch phân tích Định mức 100 ml
3.7.2. Khảo sát hiệu suất trích ly dịch Carbaryl và Dimethoate trong nước qua cácbậc trích ly. bậc trích ly.
Cách tiến hành như sau: cho 25 ml dung dịch mỗi chất Carbaryl và Dimethoate 20 ppm đã pha sẵn trích ly trong 50 ml Axeton. Sau đĩ cũng tiến hành khuấy từ để hịa tan Carbaryl và Dimethoate vào trong Axeton. Tiến hành giống các bước từ 4 đến 7 như quy trình mục 3.7.1 trên. Pha hữu cơ tách ra lần thứ nhất sau khi tiến hành các bước tiếp theo ta được dịch trích bậc 1 đem đi phân tích, tiếp tục lấy pha nước bổ sung thêm Axeton và muối đem đi khuấy từ tiếp thu đươc pha hữu cơ và nước lần 2. Pha hữu cơ tiếp tục quy trình phía sau thu dịch trích bậc 2, pha nước thu được lần 2 lại cho thêm Axeton và muối đem khuấy từ và tách pha lần 3. Pha hữu cơ thu được lần 3 tiếp tục quá trình để cĩ dịch trích bậc 3. Chỉ khảo sát 3 bậc vì vậy pha nước lần 3 được loại bỏ.
Dịch trích ly bậc 1, 2, 3 được đem đo trên máy HPLC để xác định diện tích các peak. Mỗi mẫu tiến hành đo 3 lần, lấy diện tích peak trung bình.
Để tính được hiệu suất thu hồi các chất qua các bậc trích ly ta tiến hành đồng thời đo diện tích peak của dung dịch Carbaryl, Dimethoate 20 ppm đem đi trích để so sánh. Sơ đồ quy trình trích được thể hiện ở hình 3.2: (trang 28)
3.7.3 Khảo sát độ thu hồi mẫu của quy trình trích ly Carbaryl và Dimethoate trênmẫu cải bắp mẫu cải bắp
Sơ đồ quy trình trích dựa trên quy trình ở sơ đồ hình 3.1 và kết quả chọn số bậc sẽ được trình bày ở phần kết quả và bàn luận.
Tiến hành khảo sát độ thu hồi Carbaryl và Dimethoate trên đối tượng phân tích là cải bắp. Cải bắp được mua ở chợ đem về bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh.
Để đánh giá mức độ hồn thiện của một quy trình phân tích chúng tơi dựa vào độ thu hồi mẫu. Độ thu hồi mẫu là mức độ thu hồi lượng hoạt chất đã thêm vào trong mẫu rau khi phân tích. Vì vậy ta phải biết chính xác lượng thuốc thêm vào trên rau. Và tính hiệu suất thu hồi dựa trên lượng thuốc thêm vào này. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ta tiến hành khảo sát độ thu hồi mẫu ở các nồng độ bổ sung tương ứng với lượng phun thêm 2,5 ; 5 ; 10 ml dung dịch 100 ppm Carbaryl, Dimethoate vào cải bắp và lượng thêm cũng 2,5 ; 5; 10 ml dung dịch chuẩn Carbaryl, Dimethoate 100 ppm vào dịch trích đã được lọc chân khơng.
Nước
Dịch phân tích 3 25mL Carbaryl , Dimethoate
20ppm
50mL Axeton Khuấy từ 5 – 7g NaCl
Tách pha 2mL Axetonitril Định mức 10mL Dịch phân tích 2 2nl Axetonitril
Pha hữu cơ
Cơ quay chân khơng
Tráng bình Định mức 50mL Dịch phân tích 1 Pha nước Axeton Khuấy Tách pha 2-3g NaCl
Pha hữu cơ Pha nước Khuấy
từ Tách pha Cơ quay chân khơng
Tráng bình
Hình 3.2:Sơ đồ trích ly 3 bậc
Axeton
2-3g NaCl
Xác định độ thu hồi của Carbaryl, Dimethoate của cải bắp khi bổ sung trực tiếp dung dịch chuẩn lên rau:
Với mỗi chất ta sẽ chuẩn bị 4 mẫu rau 100g trong đĩ: - Mầu 1 khơng bổ sung gì cả
- Mẫu 2 bổ sung 2,5 ml dung dịch chuẩn 100 ppm - Mẫu 3 bổ sung 5 ml dung dịch chuẩn 100 ppm - Mẫu 4 bổ sung 10 ml dung dịch chuẩn 100 ppm
Sau đĩ tiến hành trích mẫu theo quy trình đã chọn. Phân tích bằng HPLC như đã mơ tả phần trước.
Xác định diện tích peak các mẫu khơng bổ sung và cĩ bổ sung Carbaryl, Dimethoate trên rau như trên, đồng thời đo mẫu Carbaryl, Dimethoate trong nước ở nồng độ tương đương với lượng chất chuẩn bổ sung sau khi đã định mức để đem phân tích trên máy HPLC. Độ thu hồi mẫu H(%) ở mỗi nồng độ bổ sung được tính:
(Xb [Cơng thức 2]
Với Xb: diện tích peak trung bình các lần đo của mẫu cĩ bổ sung thêm chẩn X: diện tích peak trung bình các lần đo của mẫu khơng bổ sung
Xchuan: diện tích peak trung bình các lần đo của các chuẩn tương ứng nồng độ đã bổ sung.
Xác định độ thu hồi mẫu Carbaryl, Dimethoate khi bổ sung vào dịch cải bắp sau khi đã lọc bã:
Đối với mỗi chất khảo sát ta cũng tiến hành chuẩn bị 4 mẫu rau cải bắp, mỗi mẫu 100g. Mỗi mẫu cũng được trích ly 2 bậc cho cả bã và tách pha. Nhưng trong thí nghiệm này ta khơng bổ sung dung dịch chuẩn Carbaryl, Dimethoate vào trong rau mà bổ sung vào dịch qua lọc chân khơng sau khi đã trích 2 lần trên rau. Như vậy độ thu hồ lượng chất chuẩn thêm vào trong thí nghiệm này so sánh với độ thu hồi khi phun chất chuẩn trực tiếp lên rau trong thí nghiệm trên sẽ cho ta thấy sự mất mát lượng chất vẫn cịn nằm trong bã và sự tổn thất qua khâu lọc chân khơng.
Tiến hành trích ly 8 mẫu cải bắp, mỗi mẫu 100g thực hiện theo quy trình trên nhưng ở khâu dịch lọc trước khi khuấy từ 1 sẽ cĩ 6 mẫu được bổ sung các lượng tương ứng 2,5; 5; 10 ml dung dịch chuẩn 100 ppm cho mỗi chất Carbaryl, Dimethoate, 2 mẫu
H(%) = X X X chuan b ) ( 100
cịn lại khơng bổ sung gì thêm. Trong quá trình lấy mẫu, các mẫu bổ sung cùng một chất và mẫu trắng đối chứng phải lấy cùng một trái cải bắp để tránh sai số.
Phân tích trên máy HPLC mỗi mẫu 3 lần, lấy kết qủa diện tích peak trung bình đo được.
3.8. Ứng dụng quy trình phân tích Carbaryl để khảo sát sự phân hủy Carbaryltrong cải bắp sau khi chiếu xạ liều thấp. trong cải bắp sau khi chiếu xạ liều thấp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Với quy trình phân tích Carbaryl đã được khảo sát và chọn như trên, chúng tơi thực hiện trích ly các mẫu cải bắp cĩ bổ sung thêm 5 ppm Carbaryl đã được xử lý chiếu xạ ở các liều chiếu 0,2 ; 0,4; 0,6; 0,8; 1 KGy. Để xem xét sự ảnh hưởng của chiếu xạ đến lượng Carbaryl trong cải bắp là như thế nào.
Xử lý mẫu rau đem đi chiếu xạ: Ứng với mỗi liều chiếu xạ chúng tơi dùng nguyên trái cải bắp tẩm vào một lượng dung dịch chuẩn Carbaryl với hàm lượng 5 ppm tương ứng với bổ sung lượng 5 mg Carbaryl vào 1kg cải bắp. Sau khi tẩm thêm Carbaryl vào mẫu cải bắp được để qua đêm trong ngăn mát của tủ lạnh. Chuẩn bị thêm một mẫu cải bắp đối chứng nghĩa là mẫu này cũng được tẩm thêm 5 ppm Carbaryl bảo quản trong điều kiện giống các mẫu trên nhưng khơng đem đi chiếu xạ. Sau đĩ mẫu được gởi đi chiếu xạ ở Viện cơng nghệ hạt nhân Đà Lạt.
Mẫu sau khi chiếu xạ xong tiến hành lấy mỗi mẫu 100g đem đi trích ly Carbaryl và phân tích trên HPLC.
3.9. Khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình trích ly Vitamin C trong cải bắp.3.9.1. Quy trình trích ly Vitamin C trong cải bắp 3.9.1. Quy trình trích ly Vitamin C trong cải bắp
Dựa vào tài liệu tham khảo “Giáo trình phân tích thực phẩm” [10], chúng tơi xây dựng quy trình trích ly Vitamin C như sau: Lấy mẫu rau khoảng 25g đem xay trong trong dung dịch đệm KH2PO4 pH = 2,8 để trích ly Vitamin C cĩ trong cải bắp. Sau đĩ tiến hành lọc bằng hệ thống lọc chân khơng. Dịch lọc thu được được định mức lên 100 ml, sau đĩ tiếp tục lọc qua màng lọc 0,45 µm thu được dịch chiết Vitamin C cho phân tích. Dịch thu được tiếp tục pha lỗng 10 lần bằng dung dịch đệm. Sau đĩ tiến hành phân tích với dịch đã pha lỗng này trên máy HPLC. Sơ đồ quy trình trích ly Vitamin C từ cải bắp như hình 3.3 (trang 31).
3.9.2. Khảo sát hiệu suất trích ly đối với quy trình trích ly Vitamin C trong cải bắp
Để cĩ thể tính được hiệu suất thu hồi ta phải thêm lượng chất chuẩn biết trước hàm lượng vào mẫu cần phân tích và cĩ mẫu trắng đối chứng để so sánh.