Cơ sở của phương pháp là phản ứng khử Fe(III) thành Fe(II) bởi acid ascorbic. Sản phẩm Fe(II) cĩ thể được đo dễ dàng sau khi kết hợp với tác nhân màu như 1,10- phenanthroline hoặc neocuproline. Ở đây, mono (1,10-phenanthroline)-Fe(III) bị khử
trực tiếp thành tri(1,10-phenanthroline)-Fe(II) bởi acid ascorbic, sản phẩm tạo thành hấp thu ánh sáng ở bước sĩng 510 nm.
Phương pháp này rất nhạy, nhanh, và đã được nghiên cứu tự động hĩa bởi kỹ thuật tiêm dịng (FIA), cho hiệu suất phân tích 200 mẫu/giờ. Đường chuẩn của acid ascorbic trên dãy 0 - 50ppm trong điều kiện lý tưởng được ghi nhận. RSD = 0,5%( n=15).
Mono(1,10-phenanthroline)-Fe(III) cũng cĩ thể được sử dụng để định lượng adrenaline.
Hình 2.7: Ống dẫn FIA sử dụng để định lượng acid ascorbic bằng phương pháp quang phổ.
Cơ sở của phương pháp là phản ứng khử muối tetrazolium MTT [3-(4,5- dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] thành một Formazan bởi acid L-ascorbic (L-ascorbate) khi cĩ mặt của chất mang điện tử PMS (5- methylphenazinium methosulfate) tại pH = 3,5. MTT-Formazan được xác định thơng qua đo độ hấp thụ ánh sáng thấy được tại bước sĩng 578 nm.
Trong thí nghiệm với mẫu thử tổng lượng chất khử sẽ được tính tốn theo:
Ascorbate x H MT Dehydroascorbate x MTT Formazan H
L ) ( )
2 (
Để định lượng L-ascorbate, sử dụng đồng thời một mẫu trắng. Mẫu trắng này được cho phản ứng với enzym ascorbate oxidase (AAO) với sự cĩ mặt của O2 để loại đi sự cĩ mặt của L-Ascorbte (2.5). Dạng dehydroascorbate khơng phản ứng với MTT/PMS. O H orbate Dehydroasc O Ascorbate L 1/2 2 2
Sự khác nhau về độ hấp thu giữa mẫu thử và mẫu trắng sẽ chính là lượng L- Ascorbate cĩ trong mẫu.