2.2.1.1. Xác định phổ hấp thu ánh sáng của chlorophyll.[13][24]
Mục đích:
Nhằm xác định bước sĩng ánh sáng trắng mà tại đĩ dung dịch màu chlorophyll cĩ độ hấp thu cực đại. Sử dụng bước sĩng này để đo độ hấp thu dung dịch màu chlorophyll trong các thí nghiệm tiếp theo, dựa vào đĩ xác định các điều kiện tối ưu trong quá trình tách chiết cho hiệu quả tách chlorophyll cao nhất.
Tiến hành:
Nguyên liệu đã được rửa sạch, để ráo.
Lấy 1g mẫu xay nhỏ trích ly bằng cồn 96onhiều lần cho đến khi mẫu chỉ cịn là những mảnh vụn trắng (thí nghiệm tiến hành trong tối). Định mức thành 100ml, lọc dịch chiết.
Hút 1ml dịch chiết trên pha thành 10ml. Tiến hành đo độ hấp thu của dịch chiết ở các bước sĩng thay đổi từ 360 đến 700nm với nồng độ pha lỗng thích hợp tương ứng từng nguyên liệu, ta sẽ được phổ của chlorophyll trong các nguyên liệu khác nhau.
2.2.1.2. Xác định hàm lượng chlorophyll trong nguyên liệu. [13][28]
Lấy 1g mẫu xay nhỏ trích ly bằng cồn 96onhiều lần cho đến khi mẫu chỉ cịn là những mảnh vụn trắng, tiến hành trong tối. Định mức thành 100ml, lọc dịch chiết.
Hút 1ml dịch chiết trên pha thành 10ml. Đem đo độ hấp thu ánh sáng ở hai bước sĩng λ=649nm và λ= 665nm với nồng độ pha lỗng thích hợp tương ứng từng nguyên liệu.
Hàm lượng chlorophyll trong mẫu nguyên liệu được tính theo cơng thức 2.1 Ca = 13,7xD665 - 5,76xD649
Cb = 25,8xD649 - 7,6xD665
Lượng chlorophyll tổng được xác định theo cơng thức (2.1)
Phần 2: Vật liệu & phương pháp
2.2.1.3. Phương pháp chiết tách dung dịch chlorophyll từ nguyên liệu. [4][13] Nguyên tắc:
Chlorophyll bị xà phịng hố bởi NaOH tạo sản phẩm là rượu phitol, methanol và acid chlorophilic. Các acid chlorophilic cũng như muối của chúng đều cho sản phẩm cĩ màu xanh đậm.
Chlorophyll a +NaOH (C32H30ON4Mg)(COONa)2 + CH3OH + rượu phitol Chlorophyll b +NaOH (C32H28O2N4Mg)(COONa)2 + CH3OH + rượu phitol
Hố chất:
NaOH, HCl 6%,
Cách tiến hành:
Nguyên liệu (chồi Dứa, vỏ Nha Đam, rau Dền, rau Ngĩt) rửa sạch, để ráo nước, xay nhỏ.
Lấy10g nguyên liệu xay nhỏ đun cách thuỷ 90oC với thể tích nước, lượng NaOH và thời gian thích hợp. Sau khi đun để nguội đem lọc, dịch chiết thu được là dung dịch chlorophyll.
2.2.2. THU NHẬN CHẾ PHẨM CHLOROPHYLL TỪ CHỒI DỨA, VỎ NHA ĐAM, RAU DỀN, RAU NGĨT.[1][13]
2.2.2.1. Khảo sát lượng NaOH tối ưu cho quá trình tách chiết chlorophyll.
Thực hiện chiết tách chlorophyll như mục 2.2.1.3 tiến hành khảo sát lượng NaOH từ 0,3g đến 0,7g trong thời gian 150 phút. Sau khi đun để nguội, định mức thành 100ml, sau đĩ lọc thu dịch chiết.
Hút 1ml dịch chiết trên pha thành 10ml, đem đo độ hấp thu ánh sáng ở bước sĩng đã xác định theo mục 2.2.1.1 với nồng độ pha lỗng thích hợp tương ứng từng nguyên liệu.
Xác định lượng NaOH tối ưu để tách chiết chlorophyll.
2.2.2.2. Khảo sát thời gian tối ưu cho quá trình tách chiết chlorophyll
Từ lượng NaOH thích hợp cho từng loại nguyên liệu đã xác định theo mục 2.2.2.1, tiếp tục thực hiện chiết tách chlorophyll như mục 2.2.1.3 tiến hành khảo sát thời gian từ 2 giờ đến 4giờ 30phút, Sau khi đun để nguội, định mức thành 100ml, sau đĩ lọc thu dịch chiết.
Phần 2: Vật liệu & phương pháp
Hút 1ml dịch chiết trên pha thành 10ml, đem đo độ hấp thu ánh sáng ở bước sĩng đã xác định theo mục 2.2.2.1 với nồng độ pha lỗng thích hợp tương ứng từng nguyên liệu. Từ kết quả nhận được xác định thời gian tối ưu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2.3.Khảo sát tỉ lệ thể tích nước với nguyên liệu tối ưu cho quá trình tách chiết chlorophyll
Từ lượng NaOH tối ưu đã xác định theo mục 2.2.2.1 và thời gian tối ưu đã xác định theo mục 2.2.2.2 tương ứng từng loại nguyên liệu, tiếp tục thực hiện chiết tách chlorophyll như mục 2.2.1.3 tiến hành khảo sát thể tích nước tối ưu cho quá trình tách chiết chlorophyll với 10g nguyên liệu: 30ml; 40ml; 50ml; 60ml; 70ml; 80ml. Sau khi đun để nguội, định mức thành 100ml, sau đĩ lọc thu dịch chiết.
Hút 1ml dịch chiết trên pha thành 10ml, đem đo độ hấp thu ánh sáng ở bước sĩng đã xác định theo mục 2.2.2.1 với nồng độ pha lỗng thích hợp tương ứng từng nguyên liệu. Từ kết quả nhận được ta xác định tỉ lệ thể tích nước với nguyên liệu tối ưu cho quá trình tách chiết chlorophyll tương ứng từng điều kiện đã xác định theo mục 2.2.2.1 và 2.2.2.2 đối với từng nguyên liệu.
2.2.2.4. Thu nhận chế phẩm chlorophyll từ nguyên liệu
Từ kết quả xác định theo phương pháp ở mục 2.2.2ø.1, 2.2.2.2 và 2.2.2.3 thực hiện chiết tách chlorophyll như mục 2.2.1.3. Sau đĩ, trung hịa dịch chiết bằng HCl 6% đến pH=9,5. Đem sấy ở 50o C thu chế phẩm chlorophyll. Xác định trọng lượng chế phẩm chlorophyll.
2.2.2.5. Xác định hiệu suất thu chế phẩm chlorophyll so với lượng nguyên liệu tươi.[13][25]
Thực hiện thu nhận chế phẩm bột chlorophyll như mục 2.2.2.4. Xác định trọng lượng chế phẩm bột.
Hiệu suất thu chế phẩm chlorophyll so với trọng lượng nguyên liệu tươi được xác định theo cơng thức 2.2.
Trọng lượng chế phẩm chlorophyll (g)
H1%= x100 (CT 2.2) Trọng lượng nguyên liệu (g)
Phần 2: Vật liệu & phương pháp
2.2.2.6. Xác định một số chỉ tiêu của chế phẩm chlorophyll. Xác định độ ẩm chế phẩm chlorophyll.[1][10]
Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy khơ đến trọng lượng khơng đổi.
Nguyên tắc: Dùng sức nĩng làm bay hết hơi nước cĩ trong sản
phẩm. Cân trọng lượng trước và sau khi sấy đến khối lượng khơng đổi, từ đĩ tính phần trăm nước cĩ trong sản phẩm.
Cách tiến hành:
Bước 1: Cốc thuỷ tinh đem sấy đến trọng lượng khơng đổi: Cốc
thuỷ tinh đem sấy ở 100oC trong 30 phút, để nguội trong bình hút ẩm, đem cân, sau đĩ lại cho vào tủ tiếp tục sấy 30 phút nữa, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, đem cân. Tiếp tục cho đến khi kết quả hai lần cân liên tiếp khơng cách nhau quá 0,5mg.
Bước 2: Cho vào cốc đã xác định khối lượng khoảng 1,5 g mẫu.
Cho vào tủ sấy ở 100oC trong 30 phút, để nguội trong bình hút ẩm, đem cân, sau đĩ lại cho vào tủ tiếp tục sấy 30 phút nữa, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, đem cân. Tiếp tục cho đến khi kết quả hai lần cân liên tiếp khơng cách nhau quá 0,5mg.
Cách tính kết quả:
Phần trăm (%) độ ẩm trong khối lượng được tính bằng cơng thức (2.3). (G1-G2)x 100 a% = (CT 2.3) G1-G Với: G: Trọng lượng cốc (g).
G1: Trọng lượng cốc và trọng lượng của mẫu trước khi sấy đến trọng lượng khơng đổi (g).
G2: Trọng lượng cốc và trọng lượng của mẫu sau khi sấy đến trọng lượng khơng đổi (g).
Phần 2: Vật liệu & phương pháp
Xác định hàm lượng chlorophyll trong chế phẩm. [13][28]
Cân 0,1g chế phẩm chlorophyll thu nhận theo phương pháp ở mục 2.2.2.4 hồ tan trong nước, định mức 100ml bằng cồn 96o.
Hút 1ml dung dịch pha lỗng thành 10ml, đo độ hấp thu ánh sáng ở 2 bước sĩng 649nm và 665nm với nồng độ pha lỗng thích hợp tương ứng từng nguyên liệu. Xác đinh hàm lượng chlorophyll trong chế phẩm theo cơng thức (2.1).
Xác định hiệu suất thu nhận chlorophyll trong chế phẩm so với hàm lượng chlorophyll trong nguyên liệu. [12][13]
Hiệu suất thu nhận chlorophyll trong chế phẩm so với hàm lượng chlorophyll trong nguyên liệu được xác định theo cơng thức (2.4). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chl2*m2
H2% = x 100 (%) (CT 2.4) Chl1*m1
Với:
+ Chl1 : Hàm lượng chlorophyll tổng trong nguyên liệu (mg/g)
+ Chl2: Hàm lượng chlorophyll tổng trong chế phẩm chlorophyll (mg/g) + m1: Trọng lượng nguyên liệu dùng làm thí nghiệm (g).
+ m2: Trọng lượng chế phẩm chlorophyll thu được (g).
Xác định độ bền nhiệt của chế phẩm chlorophyll. [13]
Mục tiêu:
Khảo sát độ bền nhiệt của chế phẩm chlorophyll ở các nhiệt độ: 10oC (nhiệt độ lạnh), 30oC – 32oC (nhiệt độ phịng), 70oC và 100oC. Nhằm xác định sự biến đổi màu của chế phẩm chlorophyll trong ứng dụng chế biến thực phẩm.
Cách tiến hành:
Cân 0.1 g chế phẩm chlorophyll pha trong nước thành 100ml, cho vào 5 ống nghiệm bằng nhau mỗi ống 5ml thêm vào mỗi ống 40ml nước, lắc đều.
-Ống 1: đo ngay độ hấp thu ánh sáng ở bước sĩng được chọn theo mục 2.2.1.1
Phần 2: Vật liệu & phương pháp
-Ống 2: 10 C , trong 30 phút
-Ống 3: 30oC – 32oC, trong 30 phút -Ống 4: 70oC , trong 30 phút
-Ống 5: 100oC (đun cách thuỷ), trong 30 phút
Sau đĩ đo độ hấp thu ánh sáng của ống 2, 3, 4 và 5 ở bước sĩng được chọn theo mục 2.2.1.1. So sánh kết quả với ống 1 và rút ra kết luận độ bền nhiệt độ của chế phẩm chlorophyll trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau.
2.2.2.7. Khảo sát sự thay thế Cu vào nhân Mg của chlorophyll. [13] Mục tiêu:
Để cĩ màu xanh đậm hơn và giữ màu chlorophyll bền, ta cĩ thể thay thế nguyên tố Mg cĩ trong nhân của chlorophyll bằng nhân Cu.
C55H72O5N4Mg + CuSO4 C55H72O5N4Cu + MgSO4
Cách tiến hành:
Bước 1: Chọn lượng CuSO4 0,1% thêm vào dịch chiết chlorophyll. Các điều kiện tối ưu thu được từ mục 2.2.4.1 và mục 2.2.4.2, 2.2.4.3, chiết tách thu dịch chiết chlorophyll như mục 2.2.3. Tiến hành hai mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu dùng 30g nguyên liệu.
Mẫu 1: Dịch chiết + NaHCO3 1M. Sau đĩ dùng HCl 6% trung hồ đến pH =9,5. Đem sấy ở 50oC cho đến thu được bột. Chế phẩm chlorophyll được bảo quản trong tối
o Mẫu 2: Dịch chiết + NaHCO3 1M. Tiếp theo dùng 5 ống nghiệm tiến hành như sau:
Ống nghiệm 1 nghiệm 2Ống Ống nghiệm 3 Ống nghiệm 4 Ống nghiệm 5 Dịch chiết (ml) 15 15 15 15 15 CuSO4 0,1% (ml) 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Nước cất (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Lắc đều
Phần 2: Vật liệu & phương pháp
Sau đĩ dùng HCl 6% trung hồ đến pH =9,5. Đem đo độ hấp thu ánh sáng ở bước sĩng của kết quả mục 2.2.1. Chọn tỉ lệ dịch chiết với lượng CuSO4 0,1% cho OD 660nm cao nhất.
Tiếp theo thêm lượng CuSO4 0,1% vào phần dịch chiết cịn lại của mẫu 2 theo tỉ lệ đã chọn. Sau đĩ dùng HCl 6% trung hồ đến pH =9,5. Đem sấy ở 50oC cho đến thu được chế phẩm chlorophyll cĩ nhân Cu. Chế phẩm chlorophyll được bảo quản trong tối.
Bước 2: Khảo sát độ bền màu theo thời gian của hai chế phẩm
chlorophyll cĩ nhân Cu và nhân Mg. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-Cân 0,1g chế phẩm chlorophyll nhân Cu và 0,1g chế phẩm chlorophyll nhân Mg. Pha lỗng mỗi loại thành 100ml trong hai cốc riêng rẽ, đem đo OD 660nm .
-Sau 5 ngày (kể từ ngày sản xuất ra sản phẩm) cân 0,1g chế phẩm chlorophyll nhân Cu và 0,1g chế phẩm chlorophyll nhân Mg. Pha lỗng mỗi loại thành 100ml trong hai cốc riêng rẽ, đem đo OD 660nm .
-Sau 10 ngày (kể từ ngày sản xuất ra sản phẩm) cân 0,1g chế phẩm chlorophyll nhân Cu và 0,1g chế phẩm chlorophyll nhân Mg. Pha lỗng mỗi loại thành 100ml trong hai cốc riêng rẽ, đem đo OD 660nm .
-Sau 15 ngày (kể từ ngày sản xuất ra sản phẩm) cân 0,1g chế phẩm chlorophyll nhân Cu và 0,1g chế phẩm chlorophyll nhân Mg. Pha lỗng mỗi loại thành 100ml trong hai cốc riêng rẽ, đem đo OD 660nm .
Bước 3: Kết luận
So sánh giá trị OD theo thời gian của hai chế phẩm chlorophyll cĩ nhân Cu và nhân Mg và rút ra kết luận về độ bến màu theo thời gian bảo quản.
2.2.3. MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CHẾ PHẨM CHLOROPHYLL . 2.2.3.1.Nhuộm màu rau câu. 2.2.3.1.Nhuộm màu rau câu.
Tiến hành
Rau câu nấu sơi, cho tan hồn tồn, tiếp theo cho đường vào như thơng thường. Hồ sản phẩm bột chlorophyll với một ít nước, cho dịch màu chlorophyl vào hỗn hợp rau câu đường. Chúng tơi đã tiến hành với 0,2mg chế phẩm chlorophyll cho 20ml hỗn hợp rau câu đường.
Phần 2: Vật liệu & phương pháp
2.2.3.2. Nhuộm màu kem sữa tươi
Kem sữa tươi dùng để ứng dụng được mua từ cửa hàng bánh Đức Phát
Tiến hành:
Trong quá trình tiến hành, chúng tơi nhận thấy chế phẩm chlorophyll cho trực tiếp vào kem sữa tươi, trộn đều cho sản phẩm cĩ màu xanh mịn đẹp. Chúng tơi đã tiến hành với 0,1mg chế phẩm chlorophyll cho 1g kem sữa tươi.
2.2.3.3. Nhuộm màu kem đánh răng PS.
Chúng tơi tiến hành tương tự như nhuộm màu kem sữa tươi.
2.2.4. PHƯƠNG PHÁP TRONG CHIẾT XUẤT POLYPHENOL TỪ CHÈ XANH. XANH.
2.2.4.1.Phương pháp chiết xuất polyphenol từ nguyên liệu chè xanh.
[15][16][23][31]
Nguyên tắc:
Polyphenol tan tốt trong ethanol và nước, vì vậy chúng tơi dùng ethanol kết hợp nước trong qui trình tách chiết polyphenol.
Cách tiến hành:
Dùng 5g nguyên liệu kết hợp ethanol với nước để tách chiết polyphenol trong chè xanh bằng phương pháp đun hồi lưu ở nhiệt độ 40oC, thực hiện tách chiết 3 lần. Thu tất cả dịch chiết và lọc sạch đem cơ đặc thu hồi ethanol. Cặn đem sấy thu chế phẩm bột polyphenol thơ. Đem cân xác định trọng lượng bột polyphenol thơ.
2.2.4.2.Định lượng polyphenol bằng phương pháp Prussian Blue [2],[16][30] Nguyên tắc:
Hỗn hợp thuốc thử là FeCl3 và K3 Fe(CN)6 bị khử bởi các hợp chất phenol và tạo thành phức ferric (III) hexacyanoferrate (II) cĩ màu xanh.
Hố chất : dung dịch 0.02M FeCl3 trong 0.1M HCl, dung dịch 0.016M K3Fe(CN)6.
Chất chuẩn: dung dịch (+)- acid galic.
Cách tiến hành : Lấy 0.1 ml dung dịch (chất chuẩn hoặc mẫu cần đo đã pha lỗng đến nồng độ thích hợp) cho vào ống nghiệm, cho tiếp 3 ml nước cất, lắc đều, tiếp theo cho nhanh 1 ml K3Fe(CN)6 và 1 ml FeCl3,
Phần 2: Vật liệu & phương pháp
lắc đều dung dịch. Để yên dung dịch trong 15 phút, sau đĩ đem đo độ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hấp thu A tại bước sĩng λ = 700 nm.
*Lập phương trình đường chuẩn acid galic.
-Cân 0,1 g chất chuẩn (acid galic) định mức 100ml bằng nước cất. Sau đĩ pha dung dịch chất chuẩn này với các nồng độ: 0,001(g/100ml); 0,002(g/100ml); 0,004(g/100ml); 0,008(g/100ml); 0,016(g/100ml); 0,020(g/100ml); 0,025(g/100ml). Hút 0,1ml dung dịch ở các nồng độ khác nhau cho vào các ống nghiệm, tiếp tục tiến hành như trên.
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ polyphenol (g/100ml)x10-3 0 1 2 4 8 16 20 25 Nước cất (ml) 3 3 3 3 3 3 3 3 Lắc đều K3Fe(CN)6 (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 FeCl3 (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 Lắc đều
Để yên dung dịch trong 15 phút, sau đĩ đem đo độ hấp thu A tại bước sĩng = 700nm. Vẽ đường chuẩn với trục hồnh là mật độ quang, trục tung là nồng độ polyphenol (g/100ml).
2.2.4.3. Xác định hàm lượng polyphenol tổng thu nhận so với trọng lượng nguyên liệu khơ. [15][16][30]
Thực hiện chiết xuất polyphenol từ nguyên liệu như mục 2.2.4.1. Dịch chiết thu được, định mức thành 100ml, lấy 0.1 ml dịch chiết đã pha lỗng đến nồng độ thích hợp, tiến hành định lượng polyphenol như mục 2.2.4.2. Sau đĩ, xác định hàm lượng polyphenol tổng thu được trong dịch chiết trên cơ sở phương trình đường chuẩn acid galic đã lập ở mục 2.2.4.2.
Hàm lượng polyphenol tổng thu nhận theo trọng lượng nguyên liệu khơ được xác định theo cơng thức 2.6.
Phần 2: Vật liệu & phương pháp
f(A) * k
Hàm lượng polyphenol tổng (%) = x100 (CT 2.6) thu nhận theo trọng lượng nguyên liệu khơ m*(100 – w)/100
Với: f(A): Phương trình đường chuẩn k : Hệ số pha lỗng.
m : Trọng lượng nguyên liệu khơ (g) w : Độ ẩm của nguyên liệu (%).
2.2.4.4. Khảo sát ảnh hưởng các loại dung mơi khác nhau trong các lần chiết polyphenol. [23]
Mục tiêu: Lựa chọn sự sử dụng các loại dung mơi khác nhau trong các lần
ly trích của quá trình chiết polyphenol nhằm: tăng hiệu quả tách chiết, cĩ độ an tồn trong thực phẩm và dược phẩm và cĩ chi phí thấp.
Cách tiến hành:
-Dùng 5g nguyên liệu, đun hồi lưu ở nhiệt độ 40oC, tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung mơi là 1: 6 (g/ml), sau 60 phút rút dịch ly trích ra và cho dung mơi mới vào tiếp tục ly trích, tiến hành ly trích 3 lần, mỗi lần là 60 phút. Dung mơi dùng cho quá trình chiết polyphenol là ethanol 80o và nước.
-Chúng tơi tiến hành sử dụng các loại dung mơi khác nhau trong các lần chiết polyphenol ở 3 mẫu như sau:
Mẫu Lần
chiết thứ
1 2 3
I Ethanol Ethanol Ethanol
II Ethanol Ethanol Nước
III Ethanol Nước Nước
-Thu dịch chiết ở cả 3 lần ly trích, lọc sạch và tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng thu nhận theo trọng lượng nguyên liệu khơ như mục 2.2.4.2 và 2.2.4.3. Từ kết quả xác định được sự sử dụng các loại dung mơi khác nhau trong các lần ly trích tối ưu cho quá trình chiết polyphenol.
Phần 2: Vật liệu & phương pháp
2.2.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình tách chiết polyphenol. [16][23]
Từ kết quả khảo sát theo mục 2.2.4.4 tiến hành khảo sát nồng độ ethanol từ 0o đến 90o, thực hiện chiết tách polyphenol tổng như mục 2.2.4.1. Thu dịch chiết ở cả 3 lần chiết, lọc sạch và tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng thu nhận so với trọng lượng nguyên liệu khơ
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});