protein dung hợp.
Trang 5Š
Chương 2— Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học — So sánh vạch protein dung hợp với thang protein, xác định kích thước của
protein dung hợp.
c. Kiểm chứng sự hiện diện của HA
+
+
Chuyển màng
Điện di các mẫu và thang phân tử lượng có đánh dấu sẵn trên gel SDS —
PAGE, sau khi điện di cắt bỏ gel gom, đánh dấu gel phân tích. Ngâm và
lắc gel trong dung dịch chuyển màng (Towbin) 10 phút.
Chuẩn bị một màng lai nitrocellulose, hai tấm giấy thấm có kích thước
phù hợp với kích thước của gel. Ngâm màng lai và giấy thấm trong dung
dịch chuyển màng ít nhất 10 phút.
Điện chuyển màng: lắp vào hệ thống điện chuyển màng theo như hướng
dẫn của nhà sản xuất, thực hiện điện chuyển màng bằng dòng điện 25V,
350mA trong ] giờ.
Lấy màng lai ra, đánh dấu mặt trên.
— Phát hiện protein bắt đặc hiệu với kháng thể
+ + +
Sau khi đánh dấu mặt trên của màng lai, đặt ngửa màng lai vào hộp nhựa.
Cho vào IOml dung dịch khóa màng vào nhẹ nhàng hạn chế tiếp xúc trực
tiếp với màng lai, lắc nhẹ nhàng trong 1 giờ cho dung dịch tiếp xúc đều
với mặt trên của màng.
Rửa màng 2 lần bằng dung dịch PBS - T.
Cho vào 10ml dung dịch PBS — T chứa kháng thể 1/10.000, lắc nhẹ nhàng
trong 1 giờ sao cho dung dịch tiếp xúc đều với mặt trên của màng. Rửa màng 5 lần bằng dung dịch PBS - T trong vòng 30 phút. Rửa màng 5 lần bằng dung dịch PBS - T trong vòng 30 phút.
Trường hợp phát hiện protein dung hợp GST thì ủ kháng thể sơ cấp.
Trường hợp protein dung hợp 6xHis thì ủ kháng thể sơ cấp và kháng thể
thứ cấp.
Chương 2— Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
— Hiện phim
+ Đặt màng lai lên bìa nylon kiếng, phủ khắp bể mặt của màng bằng 1ml hỗn hợp detection 1 và 2. Đậy màng lai lại bằng bìa nylon kiếng. Chuyển hỗn hợp detection 1 và 2. Đậy màng lai lại bằng bìa nylon kiếng. Chuyển
vào phòng tối, áp sát mặt phim lên phía trên, đúng với vị trí của màng lai,
giữ cố định 5 — 10 phút.
Nhúng phim vào dung dịch hiện phim đến khi vạch protein xuất hiện.
Nhanh chóng chuyển phim sang dung dịch fixer, rửa đến khi nền phim trong suốt. trong suốt.
Rửa phim lại bằng nước, mang ra khỏi phòng tối, phơi khô.
2.2.11. Tinh chế HA tái tổ hợp dạng dung hợp với GST
Cấy một khuẩn lạc E. coii BL21/pG-HA có khả năng biểu hiện protein
dung hợp vào 10ml môi trường LB - Amp, lắc trong 12-— 15 giờ, ở 37C.
Cấy dịch nuôi cấy trên vào 100ml môi trường LB —- Amp sao cho ODạp đạt
0,06 - 0,07, lắc ở 37°C đến khi ODạao đạt giá trị 0,8 — 1,0.
Bổ sung dung dịch IPTG 100mM để đạt nồng độ IPTG trong dịch nuôi cấy
là 0,4mM, tiếp tục nuôi cấy lắc trong 4 giờ, ở 30C.
Thu sinh khối bằng cách ly tâm 4.000g, 16 phút, ở 4C, giữ lạnh sinh khối bằng cách ngâm ống ly tâm trong đá. bằng cách ngâm ống ly tâm trong đá.
Rửa sinh khối bằng nước cất cất để lạnh, thu lại sinh khối.
Huyễn phù sinh khối bằng 4ml dung dịch PBS 1X, bổ sung 40ul dung dịch lyzozyme 100mg/ml và 40ul dung dịch PMSE 100mM. Vortex, ủ 37C trong
30 phút, phá màng bằng sóng siêu âm 12W trong 30 giây, nghỉ 30 giây, lập lại 10 lần.
Thêm vào Triton X — 100 20% để đạt nổng độ sau cùng là 1%, đảo nhẹ
trong vòng 30 phút.
Chương 2 — Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học Ly tâm 20.000g, 10 phút, ở 4°C, thu dịch trong bên trên, sau đó lọc qua
màng lọc có đường kính 0,45um.
Nạp dung dịch PBS vào ống xylanh, điểu chỉnh đòng chảy thành từng giọt
liên tục, nối xylanh với cột sắc ký GSTrap FF 1ml sao cho không có bọt khí
Vào CỘI.
Tháo nắp ở phía dưới cột khi chắc chắn dòng chảy liên tục.
Rửa cột bằng dung dịch PBS với thể tích 5 dung tích cột.
Nạp mẫu vào ống xylanh, chỉnh tốc độ dòng chảy đạt 0,5 - 1ml/phút.
Rửa cột bằng PBS với thể tích 5 — 10 lần dung tích cột, chỉnh tốc độ dòng chảy đạt 1 — 2ml/phút.
Dung ly HA-GST bằng dung dịch dung ly với thể tích 5 — 10 lần dung tích
cột, chỉnh tốc độ dòng chảy đạt 0,5 — 1ml/phút.
2.2.12. Tình chế HA tái tổ hợp dạng dung hợp với 6xHis
Cấy một khuẩn lạc E. coii BL2I(DE3)pLysS/pE-HA có khả năng biểu hiện protein dung hợp vào 10ml môi trường LB - Amp, lắc trong 12 — 15 giờ, ở
37C.
Cấy dịch nuôi cấy trên vào 500ml môi trường LB - Amp sao cho ODạa đạt
0,06 - 0,07, lắc 37°C đến khi ODạo đạt giá trị 0,8 — 1,0.
Bổ sung dung dịch IPTG 100mM để đạt nồng độ IPTG trong dịch nuôi cấy
là 0,4mM, tiếp tục nuôi cấy lắc trong 4 giờ, ở 30°C.
Thu sinh khối bằng cách ly tâm 4.000g, 16 phút, ở 4°C, giữ lạnh sinh khối
bằng cách ngâm ống ly tâm trong đá.
Rửa sinh khối bằng nước cất lạnh, thu lại sinh khối. Huyền phù sinh khối
lại bằng 20ml dung dịch phá màng. Bổ sung dung dịch 200ul dung dịch
lyzozyme I00mg/ml và 200ul dung dịch PMSE 100mM. Vortex, ủ 37°C
Chương 2 — Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học trong 30 phút.
— Phá màng bằng sóng siêu âm 12W trong 30 giây, nghỉ 30 giây, lặp lại 30 lần.
— Ly tâm 20.000g, 10 phút, ở 4°C, thu dịch trong bên trên.
— Lọc dịch thu được sau ly tâm qua màng lọc có đường kính 0,45m.
— Cột tỉnh chế Ni - NTA 5ml được nối với một bơm nhu động với hướng đẩy
sao cho dung dịch có thể từ ngoài vào cột.
— Cân bằng cột bằng 5 lần thể tích cột dung dịch đệm phá màng (lysis buffer). Điều chỉnh tốc độ chảy là 2 — 5ml/phút. buffer). Điều chỉnh tốc độ chảy là 2 — 5ml/phút.
— Cho dung dịch protein qua cột với tốc độ chảy là 1 - 2ml/phút.
— Sau khi toàn bộ dung dịch protein đã qua cột, rửa cột bằng 5 - 10 thể tích
cột bằng dung dịch rửa (Wash buffer).
— Dung ly HA-His.Nus bằng dung dịch dung ly với thể tích 5 — 10 lần dung
tích cột, chỉnh tốc độ dòng chảy đạt I1 - 2ml/phút.
— Các phân đoạn protein thu được phân tích bằng SDS —- PAGE để xác định phân đoạn nào có protein tỉnh chế. Độ tính sạch của protein được kiểm tra và hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Bradford.
2.2.13. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
a . Dựng đường chuẩn
Chuẩn bị 2 dãy ống nghiệm, mỗi dãy 6 ống, kí hiệu 0a, 0b, 1a,lb,.... 5a, 5b.
Hút 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5ml dung dịch albumin 0,Img/ml cho lần lượt vào các ống 0a và 0b, la và Ib, 2a và 2b, 3a và 3b, 4a và 4b, 5a và 5b (lượng
albumin trong mỗi dãy ống nghiệm lần lượt là 0, 10, 20, 30, 40, 50ug).
Thêm nước cất vào mỗi ống sao cho đạt thể tích chung là 1ml.
Cho 5ml thuốc thử Bradford vào mỗi ống nghiệm, lắc đều, để yên.
Chương 2 — Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
~_ Tiến hành đo độ hấp thu của từng ống ở bước sóng 595nm ở thời điểm đúng
20 phút kể từ khi cho thuốc thử Bradford vào, _