37C.
— Cho 1ml dịch nuôi cấy trên vào 100ml môi trường LB lỏng, nuôi cấy lắc ở
37°C cho đến khi giá trị ODạna của địch nuôi cấy đạt 0,4 - 0,5.
— Ngâm bình môi trường vào nước đá trong 15 - 30 phút. Lắc nhẹ để làm
lạnh đều môi trường.
— Cho môi trường vào các ống ly tâm 50ml vô trùng đã được làm lạnh sẵn và
ly tâm thu sinh khối tế bào ở 2.000g, l5 phút, ở 4°C.
— Rửa sinh khối tế bào bằng nước cất vô trùng, lạnh và ly tâm thu lại sinh khối tế bào ở 2.000g, 15 phút, ở 4°C.
— Rửa lại sinh khối tế bào trong 25ml glycerol 10% lạnh. Ly tâm ở 2.000g, 15
Trang 4]
Chương 2 — Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
phút, 4°C, đổ bỏ nhẹ nhàng phần dịch nổi.
~ Huyền phù nhẹ nhàng sinh khối tế bào trong 5ml glycerol 10% lạnh. Tiếp tục ly tâm ở 2.000g, 20 phút, ở 4°C. Lật ngược ống đổ bỏ hết phần dịch tục ly tâm ở 2.000g, 20 phút, ở 4°C. Lật ngược ống đổ bỏ hết phần dịch
trong.
— Hòa sinh khối tế bào trong 200Hl môi trường GYT lạnh. Nhanh chóng
chuyển dịch tế bào vào các tube vô trùng, lạnh (40ul/tube). Tế bào này
được sử dụng ngay để điện biến nạp hoặc được bảo quần bằng cách giữ ở — 80°C khi chưa sử dụng. — 80°C khi chưa sử dụng.
- Chỉnh máy điện biến nạp có điện dung 25uF, hiệu điện thế 2,5kV và điện
trở 200.
— Trộn đều, nhẹ nhàng Ihl DNA plasmid hoặc sản phẩm nối trong 40ul tế
bào E. col¡ khả nạp. Giữ trong nước đá 30 — 60 giây.
¬ Chuyển dịch tế bào trên vào cuvet dùng cho điện biến nạp đã hấp và làm
lạnh trước, gõ nhẹ để dịch tế bào nằm hoàn toàn dưới đáy cuvet. Lau khô
hơi nước bám ở bề mặt ngoài cuvet và đặt vào máy điện biến nạp, nhấn nút
cho máy hoạt động.
¬ Nhanh chóng lấy cuvet mẫu ra, cho vào 1ml môi trường SOC, dùng pipet
bơm lên xuống nhiều lần để thu hồi hết các tế bào, chuyển sang một tube vô trùng. Nuôi cấy lắc trong 45 phút, ở 37C. vô trùng. Nuôi cấy lắc trong 45 phút, ở 37C.
— Lấy 100ul dịch trên trải trên môi trường LB agar 2% đã hấp khử trùng có bổ sung ampicillin nổng độ 100ug/ml, ủ trong 14 — 16 giờ, ở 37°C. bổ sung ampicillin nổng độ 100ug/ml, ủ trong 14 — 16 giờ, ở 37°C.
Tiến hành đồng thời một mẫu đối chứng không có plasmid.
Chương 2 — Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
2.2.6. Tạo dòng gen biển hiện gen HA vào vector PTZ57R/T bằng phương pháp T - A
Sản phẩm PCR của gen HA sau khi tỉnh chế được nối vào plasmid PTZ57R/T bằng phương pháp T - A để tạo plasmid tái tổ hợp. Điện biến nạp PTZ57R/T bằng phương pháp T - A để tạo plasmid tái tổ hợp. Điện biến nạp
sản phẩm nối vào tế bào E. coli DH5o, trải lên môi trường LB - Amp có bổ
sung X - gal. Chọn khuẩn lạc màu trắng làm khuẩn lạc dự tuyển. Chạy PCR
khuẩn lạc với cặp mổi HAR/HAF (khuôn DNA là tế bào E. coii DH5ơ từ khuẩn
lạc màu trắng mọc trên môi trường LB - Amp). Chọn khuẩn lạc cho phản ứng
PCR khuẩn lạc với cặp mổi HAR/HAF dương tính để tách chiết plasmid và cắt
kiểm tra plasmid đó bằng enzyme BzmHI. Plasmid sau khi cắt được phân tích trên gel agarose 1% cho kết quả phù hợp sẽ được tiến hành kiểm tra trình tự trên gel agarose 1% cho kết quả phù hợp sẽ được tiến hành kiểm tra trình tự gen HA bằng phương pháp giải trình tự gen.
2.2.7. Tạo vector pGEX-2TK có mang gen HA
Mở vòng vector pGEX-2TK bằng enzyme Ö8HI, loại bổ đầu 5° phosphate
bằng alkaline phosphatase, sau đó điện di và thu nhận qua gel agarose 1% và
tinh chế qua cột. Đoạn cắt DNA của gen #4 bằng enzyme 8zmHI trên vector tái
tổ hợp pTZ-HA được nối vào vector pGEX-2TK đã được mở vòng bằng enzyme BamHI để tạo vector tái tổ pG-HA. Điện biến nạp sản phẩm nối vào E. coli DH5œ và trải lên môi trường LB —- Amp, chọn các khuẩn lạc mọc được trên môi
trường LB - Amp. Dòng có mang pG-HA được chọn lọc bằng PCR khuẩn lạc
(khuôn DNA là tế bào E. coi từ khuẩn lạc mọc được trên môi trường LB ~ Amp) với cặp môi HAR/HAE. Chiết tách plasmid của dòng có PCR khuẩn lạc dương
tính, dùng làm bản mẫu kiểm tra cắt hạn chế bằng enzyme BzmHI. Điện di trên øel agarose 1% để kiểm tra lại kích thước của plasmid có chứa đoạn gen HA, đồng thời thực hiện PCR kiểm tra với cặp mổi HAR/HAF bắt cặp chuyên biệt
Chương 2 — Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
trên gen, kiểm tra chiểu của gen HA chèn vào vector bằng PCR với cặp môi
HAR/pGEXE. Sau khi được kiểm tra, sản phẩm nối được giải trình tự kiểm tra sự
đồng khung của protein tái tổ hợp.
2.2.8. Tạo vector pET-43.1a-e (+) có mang gen #!A
Thực hiện qui trình tương tự mục 2.2.7. nhưng thay vector pGEX-2TK bằng vector pET-43.la-c (+).
Dòng È. coli có mang vector tái tổ hợp pE-HA được chọn lọc bằng PCR
khuẩn lạc (khuôn DNA là tế bào E. coi từ khuẩn lạc mọc được trên môi trường