lạnh vào tube và ly tâm 20.000g, 10 phút, ở 4°C.
— Đổ bỏ dịch nổi bên trên và thu lấy tửa bên dưới, để khô tự nhiên trong 30 phút, ở nhiệt độ phòng. phút, ở nhiệt độ phòng.
— Thêm 20ul HO - DEPC, vortex nhẹ để hòa tan tủa. Dịch RNA này có thể
được sử dụng ngay cho phản ứng RT - PCR hoặc bảo quản ở nhiệt độ từ
- 80°C đến — 20°C.
2.2.2. Thu nhận gen mã hóa protein HA bằng phản ứng RT - PCR
Gen HA đang ở dạng RNA sẽ được chuyển thành cDNA thông qua phản
ứng phiên mã ngược (RT - Reverse Transcriptase) nhờ enzyme M - MuLV Reverse Transcriptase, và mổi oligodT. Sau đó, cDNA được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR nhờ hỗn hợp enzyme Taq DNA polymerase: P# DNA
polymerase theo tỷ lệ 1: 1, cặp mồi HAR và HAE chứa vị trí cắt của enzyme
BamHI. Sản phẩm PCR có kích thước 1724bp. Phản ứng RT được thực hiện ở
42”C trong 10 phút và enzyme được bất hoạt ở 72°C trong 10 phút. Phản ứng PCR được thực hiện lặp lại 30 chu kỳ, một chu kỳ gồm các bước là 95°C trong 10 phút, 94°C trong I phút, 60°C trong 45 giây và 72°C trong 1 phút 45 giây, sau 30 chu kỳ thêm bước ổn định nhiệt độ kéo dài ở 72°C trong 10 phút.
2.2.3. Tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS - kiểm
— Một khuẩn lạc E. coli mang plasmid được nuôi cấy qua đêm ở 37°C trong
80 ~ 100ml môi trường LB có bổ sung ampicillin nồng độ 100ug/ml.
— Chuyển dịch nuôi cấy vào ống ly tâm lớn, ly tâm thu sinh khối ở 4.000g, 10
phút, ở 4°.
Chương 2 ~ Vật liệu và phương phán Luận văn Thạc sĩ Sinh học
— Rửa sinh khối bằng 6ml nước cất, chuyển qua 4 tube loại 1,5mIl, ly tầm thu sinh khối ở 4.000g, 10 phút, ở 4°C. sinh khối ở 4.000g, 10 phút, ở 4°C.
— Thêm 200ul dung dịch Ï vào mỗi tube, vortex kỹ.
— Thêm 400Hi dung dịch H vào mỗi tube, đảo nhẹ vài lần, ủ 5 ~ 10 phút, ở
nhiệt độ phòng.
— Thêm 300ul dung dịch HH vào mỗi tube, đảo nhẹ vài lần và ủ trong đá 10
phút.
— Ly tâm thu dịch ở 20.000g, 30 phút, ở 4°C, không thắng rotor.
— Dịch nổi thu được thêm vào 600ul isopropanol vào mỗi tube, vortex nhẹ
sau đó để yên 10 phút, ở nhiệt độ phòng.
— Ly tâm thu tủa ở 20.000g, 10 phút, ở 25°C.
— Rửa tủa thu được trên bằng 600Hl cthanol 70% lạnh, ly tâm 20.000g, 3
phút, ở 4°C; lật ngược ống để bỏ ethanol, để khô tự nhiên 20 - 30 phút,
— Cho vào 500nl TE 1X và S5HI RNase vào, vortex nhẹ, ủ 30 - 60 phút, ở
37°C, sau đó gộp thể tích 2 tube thành 1 tube,
¬_ Thêm 600u1 PEG 6.000 20% vào mỗi tube, vortex, ủ 1 — 2 giờ, ở 0°C - 4°, — Ly tâm thu tủa ở 20.000g, 10 phút ở 4°C. Bỏ dịch nổi thu tủa và thấm khô.
—¬ Thêm Imil ethanol 99,9%, ly tầm thu tủa ở 20.000g, 10 phút, ở 4°C. Bỏ dịch
nổi thu tủa và thấm khô.
¬ Thêm 500u1 TE 1X và cho vào 500H] phenol đã cân bằng, vortex nhẹ.
— Ly tâm thu địch nổi ở 20.000g, 10 phút, ở 4°. — Thêm 500u1 chloroform lạnh, lắc nhẹ. — Thêm 500u1 chloroform lạnh, lắc nhẹ.
Chương 2 ~ Vật liệu và phương pháp +Luận văn Thạc sĩ Sinh học
~ Ly tâm thu địch nổi ở 20.000g, 10 phút, ở 4°C.
— Thêm 4ÖHl sodium acetate và Imi ethanol 99,9% lạnh, lắc nhẹ.
— Ly tâm thu tủa ở 20.000g, 10 phút, ở 4°C. Bỏ dịch nổi thu tủa và thấm khô.
— Rửa tủa bằng 500Hl cthanol 70% lạnh và ly tâm thu tủa ở 20.000g, 3 phút, ở
4°C. Bỏ dịch nổi thu tủa và để khô tự nhiên 20 — 30 phút.
~ Thêm l00ul TE 1X vào mỗi tube, vortex nhẹ và gộp thể tích 2 tube thành 1
tube.
— Đo OD, xác định nỗng độ DNA có trong mẫu thu được.
2.2.4. Cắt giới hạn
Phản ứng cắt giới hạn được sử dụng cho việc chuẩn bị DNA cho phần ứng
nối trong tạo dòng và để kiểm tra các plasmid được chế tạo.
Phần ứng cắt giới hạn chuẩn bị DNA tạo dòng có thành phần và điều kiện
cắt như sau:
ĐNA Gu£) -
Đệm 10X 10U1
BSA 0,1% 10M
Enzyme BamHI (10U/H)) 2nl
Thêm nước cất đủ 100Ul
Ủ trong 4 giờ ở 37C, bất hoạt enzyme trong lÔ phút ở 70°C. Sau đó, xứ lý
bằng enzyme alkaline phosphatase loại bổ phosphate ở đầu 5°, điện di trên gel
agarose 1% để thu nhận và tính chế DNA cho việc dòng hóa.
Trang 49
Chương 2 — Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Phản ứng cắt giới hạn được sử dụng để kiểm tra kích thước plasmid có
thành phần và điều kiện cắt như sau:
DNA (lug) -
Đệm 10X 2ul
Enzyme BzmHI (10U/U]) 0,5ul
Thêm nước cất đủ 20ul
Ủ trong 4 giờ ở 37°C, bất hoạt enzyme trong 10 phút ở 70°C. Sau đó, điện
di trên gel agarose 1% để kiểm tra kích thước plasmid sau khi biến nạp và tách
chiết.
2.2.5. Phương pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả nạp và phương pháp biến nạp Việc biến nạp E. coli được thực hiện bằng phương pháp hóa biến nạp và Việc biến nạp E. coli được thực hiện bằng phương pháp hóa biến nạp và điện biến nạp
a. Phương pháp hóa biến nạp
Cấy 50ul E. eolí vào 5ml môi trường LB lồng, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37°C
Cho 1ml dịch nuôi cấy trên vào 100ml] môi trường LB lồng, nuôi cấy lắc ở
37°C cho đến khi giá trị ODạpạ của dịch nuôi cấy đạt 0,5 - 0,6.
Cho ống môi trường trên vào nước đá trong 15 - 20 phút. Lắc nhẹ để làm lạnh đều môi trường. lạnh đều môi trường.
Cho môi trường nuôi cấy vào các ống ly tâm 50ml vô trùng đã được làm lạnh, ly tâm thu sinh khối tế bào ở 2.000g, 15 phút, ở 4”C.
Rửa lại sinh khối tế bào bằng nước cất vô trùng, đã được làm lạnh, sau đó
ly tâm thu sinh khối tế bào ở 2.000g, 15 phút, 4°C.
Rửa lại sinh khối tế bào bằng 5ml CaCl; 20mM - MgCl; 80mM lạnh, ly tâm
thu sinh khối 2.000ø, 15 phút, 4°C.
Chương 2 — Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
~ Sinh khối tế bào được huyền phù nhẹ nhàng trong 5ml CaCl; 100mM lạnh, ủ trong đá ít nhất 1 giờ. Sau đó ly tâm thu sinh khối 2.000g, 15 phút, 4°C. ủ trong đá ít nhất 1 giờ. Sau đó ly tâm thu sinh khối 2.000g, 15 phút, 4°C. — Huyền phù nhẹ sinh khối trong 2ml CaCl; 100mM, chia đều 100u1 tế bào
vào các tube dùng làm tế bào khả nạp.
— Trộn đều nhẹ nhàng DNA plasmid (~5Ông) trong 100H] tế bào E. coli khả
nạp.
— Đặt mẫu vào máy điểu nhiệt theo chương trình biến nạp: 4°C trong 15 phút , 42°C trong 45 giây và 4°C trong 15 phút, , 42°C trong 45 giây và 4°C trong 15 phút,
— Cho tế bào sau khi biến nạp plasmid vào Iml môi trường SOC, nuôi cấy, lắc trong 30 phút, ở 379C, lắc trong 30 phút, ở 379C,
— Lấy 100ul địch trên trải lên môi trường LB agar 2% đã hấp khử trùng có bổ
sung ampicHiin nồng độ 100ug/ml, ủ trong 14 — 16 giờ, ở 37°C.
Tiến hành đồng thời một mẫu đối chứng không có plasmid. b. Phương pháp điện biến nạp b. Phương pháp điện biến nạp