V. Chức năng của DNA
5. Cỏc vũng/chu kỳ khuyếch đại cứ tiếp diễn mau lẹ sinh ra số lượng lớn cỏc đoạn giống nhau Mỗ
lẹ sinh ra số lượng lớn cỏc đoạn giống nhau. Mỗi đoạn cú chứa vựng DNA cần quan tõm.
Hỡnh 5.13 Sơđồ minh họa quy trỡnh kỹ thuật PCR do Kary Mullis đề xuất.
sự tỏi bản xảy ra trong tế bào, ở chỗ:
(1) DNA sợi kộp được tỏch thành cỏc sợi đơn. Tuy nhiờn, trong PCR, thỡ nhiệt chứ khụng phải enzyme được dựng để làm biến tớnh DNA. (2) Cỏc mẩu nucleotide ngắn được dựng làm mồi để khởi đầu tỏi bản. Cỏc đoạn mồi của PCR được tổng hợp từ cỏc deoxynucleotide. Chỳng bổ sung với cỏc trỡnh tựở hai đầu của gene quan tõm. Một đoạn mồi kết dớnh vào đầu 3' của mỗi một sợi DNA bổ sung.
(3) DNA polymerase tiếp tục kộo dài sợi DNA mới từ đầu 3'-OH của cỏc đoạn mồi. Sản phẩm của sự tỏi bản bỏn bảo toàn này là hai sợi con.
Ưu thế của PCR là ở chỗ, cứ sau mỗi vũng hay chu kỳ tỏi bản thỡ thế hệ DNA sợi kộp con lại bị biến tớnh, nếu tiếp tục bổ sung cỏc đoạn mồi thỡ quỏ trỡnh này lại tiếp diễn. Nhờ sử dụng cỏc thiết bị tự động, mỗi chu kỳ tỏi bản cú thể hoàn thành chưa đầy 5 phỳt. Bằng cỏch đú, từ một mẩu DNA đơn cú thể khuyếch đại lờn 1.000 lần sau 10 chu kỳ (210 = 1.024 ≈ 103). Và sau 30 chu kỳ, từ một phõn tử DNA ban đầu được khuyếch đại lờn hơn một tỷ bản sao (230 = 1,02 x 109).
Ứng dụng của PCR: Trờn thực tế, PCR được dựng để tạo cỏc mẩu dũ (probe) nucleic acid cho việc xỏc định cỏc vi sinh vật. Chẳng hạn, nú cú thể phỏt hiện số lượng nhỏ cỏc tỏc nhõn gõy bệnh trong cỏc mẩu lõm sàng và qua đú chẩn đoỏn cỏc bệnh gõy ra bởi cỏc tỏc nhõn khú nuụi cấy, như virus HIV/AIDS, Mycobacterium tuberculosis sinh trưởng chậm v.v. PCR cũng đó được dựng để khuyếch đại cỏc gene người phục vụ cho việc phõn tớch trỡnh tự trong dự ỏn bộ gene người (HGP), chẩn đoỏn cỏc bệnh di truyền, và xỏc định cỏc nghi can thuộc cỏc trường hợp tội phạm (hoặc để chứng minh cho sự vụ tội của họ). Thậm chớ ngay cả những vết mỏu nhỏ nhất hoặc một sợi túc cũn sút lại ở hiện trường phạm tội vẫn cú thể dựng làm khuụn cho PCR - khuyếch đại đủ số DNA cần thiết cho việc kiểm tra DNA. DNA này được phõn cắt bằng cỏc enzyme giới hạn (restriction enzyme), và cỏc phõn đoạn tạo ra được tỏch riờng theo kớch thước và thành phần bằng cỏch chạy điện di gel (gel electrophoresis). [Theo nguyờn tắc, sự di chuyển của cỏc phõn tử qua bản gel lỗ xốp đỏp ứng với dũng điện - cỏc đoạn càng bộ di chuyển càng nhanh hơn so với cỏc đoạn lớn hơn]. Sau đú mẩu DNA này được đem so với mẩu của nghi can đang tạm giam. Nếu như nú trựng khớp, cú thể dựng làm chứng cứ xỏc nhận nghi can đó gõy ỏn hoặc phạm tội ở hiện trường đú, giống như cỏc dấu võn tay là bằng chứng hợp phỏp vậy.
Núi chung, PCR là một kỹ thuật cú ưu thế rất lớn và được sử dụng rất phổ biến trong cỏc nghiờn cứu liờn quan đến cụng nghệ sinh học. Với
đúng gúp to lớn của sự phỏt minh ra phương phỏp PCR này, Kary Mullis đó được trao giải thưởng Nobel năm 1993 (cựng với Michael Smith, người đề xuất phương phỏp gõy đột biến định hướng, site-directed mutagenesis và sự phỏt triển của nú trong cỏc nghiờn cứu protein).
Ở nước ta, trong thời gian gần đõy, phương phỏp PCR cũng đó được ỏp dụng rộng rói trong cỏc nghiờn cứu liờn quan cụng nghệ sinh học và giải quyết cỏc vấn đề xó hội khỏc. Một trong những hướng ứng dụng đú là kết hợp kỹ thuật PCR với cỏc marker phõn tử khỏc nhau để nghiờn cứu tớnh đa dạng di truyền của nguồn tài nguyờn động vật và thực vật ở Việt Nam. Chẳng hạn, Nụng Văn Hải và cs (1999) đó bước đầu ỏp dụng kỹ thuật PCR kết hợp với việc phõn tớch enzyme giới hạn đoạn sản phẩm thu được, D-LOOP (~1,3 Kb), trong vựng điều khiển của DNA ty thể để tiến hành phõn loại học phõn tử và nghiờn cứu vấn đề đa dạng di truyền ở ba loài Gà lụi (Lophura) ở Việt Nam. Tương tự, cỏc tỏc giả cũng đó thụng bỏo cỏc kết quả phõn tớch cỏc đoạn gene 18S rRNA (~0,25 Kb) ở cỏc chủng Tuyến trựng ký sinh và ở cụn trựng ở cõy Bỡnh vụi (1,7 Kb). Trần Thị Hoà và Triest (1999) sử dụng kỹ thuật PCR-RAPD trong nghiờn cứu đa hỡnh di truyềnở thực vật v.v.
Đối với cỏc nghiờn cứu ở cõy lỳa (Oryza sativa), cú khỏ nhiều cụng trỡnh nghiờn cứu ứng dụng kỹ thuật PCR và cỏc marker phõn tử khỏc nhau. Chẳng hạn, trong cỏc nghiờn cứu về tớnh đa dạng phõn tử và đỏnh giỏ quỹ gene (Nguyễn Đức Thành và cs 1999; Bựi Chớ Bửu và Nguyễn Thị Lang 1999). Trong cỏc nghiờn cứu chọn tạo giống lỳa, cú một số cụng trỡnh như: Tạo dũng phõn tử và biểu hiện cỏc gene liờn quan Myb ở hạt lỳa (Nguyễn Hoàng Lộc và cs 1999); đỏnh giỏ nguồn gene khỏng bệnh đạo ụn phục vụ cụng tỏc chọn tạo giống lỳa (Ló Tuấn Nghĩa 2001) v.v.
Ngoài ra, gần đõy ở nước ta cũng đó thành lập một số Trung tõm phõn tớch DNA hoạt động trong cỏc lĩnh vực hỡnh sự (thuộc Bộ Cụng an), tư vấn di truyền (của GS Lờ Đỡnh Lương), và trong cỏc xột nghiệm DNA liờn quan đến sự chẩn đoỏn cỏc bệnh ở một số Bệnh viện lớn trong cả nước. 5.2. Tổng hợp cDNA nhờ enzyme phiờn mó ngược
Trong trường hợp cần thiết (chẳng hạn, đối với kỹ thuật tạo dũng để biểu hiện sản phẩm của một protein mong muốn), người ta cú thể tổng hợp gene của nú dựa trờn khuụn mẫu mRNA và enzyme phiờn mó ngược
(reverse transcriptase = RTase) được tinh chiết từ cỏc retrovirus.
Nhưđó biết, hầu hết cỏc mRNA eukaryote đều cú đuụi poly(A) ởđầu 3'. Chớnh trỡnh tự nầy tạo điều kiện thuận lợi cho việc tổng hợp sợi DNA bổ sung (cDNA). Khi đem trộn lẫn cỏc đoạn ngắn gồm cỏc nucleotide
thymine (oligodT) với mRNA này sẽ xảy ra sự lai hoỏ giữa nú với vựng đuụi của mRNA. Đoạn oligo(dT) làm mồi cho RTase tổng hợp sợi cDNA, sản phẩm ban đầu là sợi kộp lai RNA- cDNA. Ở đầu 3' của sợi cDNA được tổng hợp cú cỏi 'mũ' (tương tự đầu 5' của mRNA). Tiếp theo, bằng cỏch xử lý với NaOH, sợi mRNA được tỏch ra; kế đú 'mũ' ở đầu 3' của cDNA lại làm mồi cho DNA polymerase I tổng hợp sợi thứ hai bằng cỏch kộo dài tiếp tục nú dọc theo sợi khuụn vốn cú này. Vỡ vậy sản phẩm cDNA bõy giờ cú mang một cấu trỳc 'vũng' sợi đơn. Sau đú, vũng này được cắt bỏ bằng cỏch xử lý với nuclease S1 để tạo ra cDNA sợi kộp (hỡnh 5.14).
Phiờn mó
ngược
Mồi (primer)
Hỡnh 5.14 Tổng hợp cDNA từ một RNA nhờ sử dụng enzyme phiờn mó ngược.