V. Chức năng của DNA
Sinh tổng hợp Nucleotide và DNA
Sau khi khỏm phỏ ra cấu trỳc DNA, Watson và Crick đó đề xuất ba kiểu truyền thụng tin di truyền cú thể cú trong cỏc tế bào: (1) Tỏi bản
(replication): DNA→DNA; (2) Phiờn mó (transcription): DNA→ RNA; và (3) Dịch mó (translation): RNA→ Protein. Cỏc kờnh truyền thụng tin này cũn được gọi là Giỏo lý trung tõm (central dogma) của sinh học phõn tử. Sau này đến năm 1970, Baltimore và Temin trờn cơ sở nghiờn cứu cơ chế hoạt động của bộ gene RNA ở virus Sarcoma đó bổ sung thờm kờnh RNA→ DNA, gọi là phiờn mó ngược (reverse transciption). (Hỡnh 5.1)
Hỡnh 5.1 Giỏo lý trung tõm của sinh học phõn tử (cú sửa đổi).
Trong chương này, chỳng ta sẽ tỡm hiểu cỏc quỏ trỡnh sinh tổng hợp cỏc nucleotide và tỏi bản của DNA, kể cả bộ gene RNA của một số virus. Ngoài ra, chương này cũng đề cập đến cả cơ sở phõn tử của cỏc quỏ trỡnh phỏt sinh đột biến và tỏi tổ hợp DNA như là thuộc tớnh thứ hai của DNA.
I. Sinh tổng hợp cỏc nucleotide
Cỏc quỏ trỡnh sinh tổng hợp cỏc ribonucleotide và deoxyribo- nucleotide cú ý nghĩa cực kỳ quan trọng đối với cỏc tế bào, vỡ chỳng là cỏc tiền chất cơ bản cho tổng hợp DNA và RNA. Hơn nữa, cỏc nucleotide đúng vai trũ quan trọng trong hầu hết cỏc quỏ trỡnh trao đổi chất và năng lượng của tế bào. Chẳng hạn, ATP về bản chất là nucleotide của adenine - cơ chất toàn năng trong trao đổi năng lượng sinh học, và là thành phần chớnh của cỏc coenzyme như NAD+, NADP+, FAD và CoA. Một số nucleotide như cAMP cú vai trũ nổi bật trong cơ chế điều hoà hoạt động gene và tải nạp tớn hiệu (signal transduction) ở cỏc tế bào prokaryote và eukaryote. Cỏc nucleotide khỏc cũng cần thiết cho cỏc quỏ trỡnh tổng hợp cỏc hợp chất carbohydrate, lipid, amino acid, nucleic acid và protein.
1. Sinh tổng hợp cỏc nucleotide purine
Để tổng hợp mới (de novo) purine tạo ra IMP, một nucleotide của hypoxanthine, cú tất cả 10 giai đoạn được xỳc tỏc bởi cỏc enzyme mà chất trung gian đều là cỏc ribonucleoside - 5'-monophosphate.
Ở giai đoạn thứ nhất, 5'-phosphoribosine-1-pyrophosphate (PRPP) chuyển hoỏ thành trong một phản ứng phụ thuộc vào glutamine và đưa vào N-9 của vũng purine, như sau:
X PRPP + Glutamine → 5-phosphoribosylamine + PPi + Glutamate Chất trung gian 5-phosphoribosylamine này lại phản ứng với glycine đưa vào C-4, C-5 và N-7. Cỏc nguyờn tử cũn lại của vũng purine lần lượt được đưa vào từng cỏi một, như sau đõy:
Y 5-phosphoribosylamine + Glycine → Glycinamide ribonucleotide
Z Glycinamide ribonucleotide + N5,N10-methynyl-FH4
→Formylglycinamide ribonucleotide + FH4
[ Formylglycinamide ribonucleotide + Glutamine →Formylglycinamine ribonucleotide + Glutamate
\ Formylglycinamine ribonucleotide (đúng vũng) →5- Aminoimidazole ribonucleotide
] Aminoimidazole ribonucleotide + CO2
→5- Amino-4-carboxyamidazole ribonucleotide
^ 5- Amino-4-carboxyamidazole ribonucleotide + Aspartate
→5- Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide + Fumarate
_ Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide + N10, Formyl-FH4 →N- Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide + FH4
` N- Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide →Inosine monophosphate (IMP) + H2O.
a IMP cú thể chuyển hoỏ thành Guanosine monophosphate (GMP) nhờ sự oxy hoỏ và amin hoỏ ở C-2, hoặc thành Adenosine monophosphate
(AMP) nhờ amine hoỏ C-6. Trong phản ứng này, aspartate là chất cho nhúm amin và trở thành fumarate. Điều này được minh hoạ như sau:
• * IMP + NAD + H2O →Xanthylate (XMP) + NADH + H+ * XMP + Glutamine + ATP → GMP + Glutamate + AMP + PPi
• * IMP + Aspartate + GTP →Adenylsuccinate + GDP + Pi * Adenylsuccinate → AMP + Fumarate
Như vậy việc tổng hợp cỏc purine đũi hỏi phải được cung cấp glutamine như một nguồn nguyờn tử nitơ và cỏc chất dẫn xuất của tetrahydrofolate vốn cung cấp cỏc gốc carbon đơn. Hiện tượng amin hoỏ phụ thuộc glutamine bịức chế bởi cỏc chất tương tự glutamine và cỏc chất khỏng sinh do vi khuẩn Streptomyces sinh ra.
2. Sinh tổng hợp cỏc nucleotide pyrimidine
Trong phần này xem xột chủ yếu sỏu giai đoạn của quỏ trỡnh tổng hợp UMP (uridine-5'-monophosphate), được túm lược như sau:
X Tạo thành carbamyl aspartate từ glutamine và bicarbonate cựng với 2 phõn tử ATP nhờ enzyme carbamyl phosphate synthetase;
Glutamine + 2ATP + HCO3-→ H2N-COOPO3-2 + Glutamate + 2ADP+ HPO4-2
Y Tạo thành carbamyl aspartate: Carbamyl phosphate nhường nhúm carbamoyl cho nhúm α-amin của aspartate để tạo thành carbamyl aspartate;
Z Tạo thành dihydroorotate bằng cỏch loại một phõn tử nước;
[ Tạo thành orotate nhờ sự tham gia của coenzyme NAD+, giải phúng NADH+ và H+;
\ Orotate kết hợp với PRPP tạo ra Orotidine monophosphate và giải phúng PPi;
] Orotidine monophosphate khử carboxyl tạo thành Uridne monophosphate hay uridilic acid (UMP).
* Giống như cỏc nucleotide purine, cỏc nucleotide pyrimidine cũng cú thể được tạo thành từ cỏc pyrimidine tự do hoặc từ cỏc nucleoside (con đường trao đổi bổ sung) sau đõy:
• Uracil + ribose-1-P ↔ Uridine + Pi ; [nucleotide phosphorylase] Uridine + ATP → UMP + ADP ; [nucleoside kinase]
• Uracil + PRPP ↔ UMP + PPi ; [nucleotide phosphorylase] Nhờ quỏ trỡnh phosphoryl hoỏ, UMP được biến đổi thành UDP và UTP cung cấp cho tổng hợp RNA.
* Cỏc nucleotide cytidine được hỡnh thành trong quỏ trỡnh amin hoỏ phụ thuộc vào glutamine và cơ chất UTP, được tạo ra qua hai lần phosphoryl hoỏ UMP:
UMP + ATP → UDP + ADP UDP + ATP → UTP + ADP
Ởđõy UTP nhận nhúm từ NH3 hoặc glutamine để tạo thành CTP. * Đối với việc tổng hợp dTMP (deoxythymidine-5'-monophosphate) cú thể xảy ra theo một trong hai con đường sau:
(1) dUMP là tiền chất trực tiếp của dTMP, được tạo ra do thuỷ phõn dUTP (phản ứng này ngăn cản việc đưa dUTP vào DNA):
dUTP + H2O→ dUMP + PP
Ngoài ra dUMP cũng cú thể được tạo ra bằng cỏch khử nhúm amin của dCMP theo phản ứng sau:
dCMP + H2O→ dUMP + NH3
Cỏc dUMP được hỡnh thành theo hai cỏch núi trờn cú thểđược methyl hoỏ để trở thành dTMP: dUMP → dTMP.
(2) Sự tổng hợp bắt đầu từ thymine và deoxyribose-1-phosphate theo chuỗi phản ứng sau đõy:
Thymine + deoxyribose-1-P ↔ deoxythymidine + Pi Deoxythymidine + ATP ↔ dTMP + ADP
dTMP + ATP ↔ dTDP + ADP dTDP + ATP ↔ dTTP + ADP
Trờn thực tế cú thể xảy ra cỏc phản ứng biến đổi qua lại đối với cỏc ribonucleoside thuộc purine hoặc pyrimidine (ký hiệu: N) như sau:
N ↔ NMP ↔ NDP ↔ NTP
hoặc cỏc phản ứng của cỏc deoxyribonucleoside thuộc purine hay pyrimidine (dN):
dN ↔ dNMP ↔ dNDP ↔ dNTP
Ngoài ra, cỏc deoxyribonucleotide cú thể hỡnh thành trực tiếp từ cỏc ribonucleotide bằng cỏch khử nguyờn tử oxy ở C-2' của đường ribose trong nucleoside diphosphate (NDP = ADP, GDP, UDP, CDP). Phản ứng này được xỳc tỏc bởi ribonucleotide reductase. [Chất khử trung gian là
thioredoxin cú thể cho 2 điện tử cựng với sự oxy hoỏ 2 phõn tử cysteine (– SH)2 thành một cystine (S–S). Cũn thioredoxin oxy hoỏ thỡ bị khử bởi NADPH dưới tỏc dụng của thioredoxin reductase.] Từđõy cỏc deoxyribo- nucleoside diphosphate (dNDP = dADP, dGDP, dUDP, dCDP) lại được phosphoryl hoỏ tiếp bởi enzyme kinaseđể tạo thành cỏc dNTP tương ứng dựng làm nguyờn liệu cho quỏ trỡnh sinh tổng hợp DNA (tỏi bản).
Cần lưu ý rằng, khi cỏc nucleic acid bị phõn huỷ sẽ sinh ra cỏc nucleoside monophosphate (NMP) để rồi cỏc NMP này lại bị phõn giải tiếp bởi cỏc enzyme nucleotidase, nucleoside phosphorylase và deaminase.
Sau đú cỏc purine và pyrimidine tự do cú thểđược sử dụng lại để tổng hợp cỏc nucleotide bằng con đường tỏi sử dụng, trong đú cú phản ứng với PRPP do enzyme phosphoribosyl transferase xỳc tỏc.
Một khi cỏc purin bị phõn giải đến cựng bởi enzyme xanthine oxydase và tạo thành uric acid quỏ nhiều sẽ gõy ra bệnh Gout. Cũn cỏc pyrimidine khi bị phõn giải thỡ được thải ra dưới dạng β-alanine hoặc cỏc dẫn xuất của nú. Chớnh nhờ cỏc cơ chế kiểm soỏt kiểu liờn hệ ngược (dương tớnh và õm tớnh) đối với sự tổng hợp nucleotide mà tế bào cú được sự cõn đối về hàm lượng bốn loại nucleotide cần cho quỏ trỡnh sinh tổng hợp DNA.
Những sai sút về mặt di truyền liờn quan đến sự trao đổi chất của cỏc purine và pyrimidine là nguyờn nhõn dẫn tới xuất hiện nhiều căn bệnh như Gout, bệnh Lesh-Nyhan và nhiều bệnh suy giảm miễn dịch khỏc.
II. Sinh tổng hợp DNA (tỏi bản)
Tỏi bản (replication) là một đặc tớnh quan trọng nhất của vật chất di truyền, nhờđú sự sống được duy trỡ liờn tục, cỏc loài bảo tồn được tớnh chất đặc trưng của mỡnh, và con cỏi thường giống bố mẹ. Vậy DNA và cỏc bộ gene núi chung được tỏi bản như thế nào?
Hỡnh 5.2 Mụ hỡnh tỏi bản bỏn bảo toàn của DNA do Watson đề xuất (a), và giả định của Luria và Delbruck về ba kiểu tỏi bản cú thể cú (b).
Trong khi khỏm phỏ ra mụ hỡnh cấu trỳc DNA, chớnh Watson đó đưa ra dựđoỏn chớnh xỏc (dựa trờn nguyờn tắc bổ sung của cỏc cặp base) rằng sự tỏi bản DNA phải diễn ra theo kiểu bỏn bảo toàn (semi-conservative) nhưở hỡnh 5.2a. Đến 1956, Salvador Luria và Max Delbruck đề nghị ba kiểu tỏi bản cú thể cú (Hỡnh 5.2b): bỏn bảo toàn, bảo toàn (conservative)
và phõn tỏn (dispersive). Tuy nhiờn, nhiều thớ nghiệm sau đú đó nhanh chúng khẳng định sự tỏi bản DNA diễn ra theo kiểu bỏn bảo toàn.
Điển hỡnh là thớ nghiệm của Meselson và Stahl năm 1958 trờn đối tượng là E. coli bằng phương phỏp đỏnh dấu đồng vị phúng xạ N15 (nitơ nặng) kết hợp với ly tõm siờu tốc (ultra-centrifugation). Đầu tiờn cho vi khuẩn này sinh trưởng trờn mụi trường N15; rồi đưa trở lại mụi trường N14 (nitơ nhẹ) và sau một, hai hoặc ba thế hệ đều cú lấy cỏc mẫu DNA. Để tỏch DNA nặng và nhẹ, người ta cho trộn lẫn cỏc mẫu này với Cesium chloride (CsCl) trước khi đem ly tõm. Khi ly tõm, DNA cú cỏc tỷ trọng nặng (heavy), nhẹ (light) và trung bỡnh (intermediate) sẽ tỏch thành cỏc vạch tương ứng khỏc nhau trong ống nghiệm (Hỡnh 5.3).
Cỏc kết quả cho thấy rằng sau một thế hệ, 100% DNA sợi kộp cú tỷ trọng trung bỡnh, nghĩa là một sợi nặng (từ dạng cha mẹ) và một sợi nhẹ (được tổng hợp mới). Kết quả này cho phộp khẳng định sự tỏi bản xảy ra theo kiểu bỏn bảo toàn đỳng như Watson dựđoỏn từ trước.
Trỡnh bày Kết quả Phương phỏp Mẫu sau 0 phỳt 20 phỳt 40 phỳt P F1 F2 DNA nhẹ→
DNA trung gian → DNA nặng →
Hỡnh 5.3 Thớ nghiệm Meselson-Stahl về sự tỏi bản bỏn bảo toàn của DNA.
1. Những nguyờn tắc và đặc điểm chung của tỏi bản DNA
(i) Tỏi bản theo kiểu bỏn bảo toàn và giỏn đoạn (discontinuous); (ii) Sự tỏi bản được bắt đầu tại một hoặc nhiều vị trớ đặc thự trờn phõn tử DNA và diễn ra đồng thời theo hai hướng ngược nhau gọi là khởi điểm tỏi bản hai hướng (bidirectional origin of replication). Nghĩa là, từ khởi điểm này DNA sợi kộp mở xoắn thành hỡnh vũng sinh trưởng theo hai hướng đối lập nhau tạo ra hai chạc tỏi bản (replication fork). Mỗi khởi điểm tỏi bản cựng với hai chạc như vậy goi là một đợn vị tỏi bản
với cỏc DNA mạch vũng (bộ gene một số virus, vi khuẩn, cỏc plasmid và cỏc DNA bào quan của eukaryote), mỗi phõn tử chỉ cú một khởi điểm tỏi bản; trong khi đú mỗi DNA trong nhiễm sắc thể eukaryote cú nhiều khởi điểm tỏi bản hoạt động theo một trỡnh tựđặc thự (Hỡnh 5.5).
(iii) Quỏ trỡnh tỏi bản DNA phụ thuộc vào một hệ thống gồm nhiều protein và enzyme khỏc nhau (xem mục 2);
Sợi dẫn đầu (leading strand) 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’
replication fork replication fork
Sợi ra chậm (lagging strand)
Hỡnh 5.4 Một khởi điểm với hai chạc tỏi bản sinh trưởng theo hai hướng
đối lập nhau. Để tổng hợp DNA, cỏc đoạn mồi (RNA primer) phải được tổng hợp trước. Ở hỡnh dưới cựng cho thấy phương thức tỏi bản nửa giỏn đoạn xảy ra đồng thời ở cả hai chạc tỏi bản (replication fork) của mỗi đơn vị tỏi bản.
(iv) Tại mỗi chạc tỏi bản, trước tiờn xảy ra sự tổng hợp cỏc đoạn mồi
RNA (primer) bởi vỡ cỏc DNA polymerase tự nú khụng thể bắt đầu tổng hợp mới được. Mặt khỏc, do hai sợi đơn của mỗi chạc phõn cực ngược chiều nhau trong khi cỏc enzyme DNA polymerase và RNA polymerase chỉ xỳc tỏc theo chiều 5'3', cho nờn phương thức tỏi bản DNA diễn ra trờn hai sợi khuụn là khụng giống nhau: một sợi liờn tục hay cũn gọi là sợi dẫn đầu (leading strand) và một sợi khụng liờn tục hay cũn gọi là sợi ra
chậm (lagging strand). Kiểu tỏi bản như thế gọi là tỏi bản nửa giỏn đoạn
(semi-discontinuous). Sự tổng hợp khụng liờn tục dưới dạng cỏc đoạn cú độ dài 1.000-2.000 nucleotide do R. Okazaki phỏt hiện đầu tiờn năm 1969, nờn cũn gọi là cỏc đoạn Okazaki (Okazaki fragments). Sau đú, cỏc đoạn mồi sẽ được cắt bỏ và chỗ trống được thay thế bằng DNA, và cỏc đoạn Okazaki được nối lại với nhau bởi enzyme DNA ligase.
2. Cỏc enzyme tham gia tỏi bản DNA
Mặc dự mỗi nhúm sinh vật cú một hệ thống cỏc enzyme và protein tỏi bản riờng, song chỳng cú cỏc enzyme với vai trũ chung nhất sau đõy:
Bảng 5.1 Đặc tớnh của cỏc DNA polymerase ở E. coli và người DNA polymerase