V. Chức năng của DNA
E. coli Po lI Pol II Pol
Polymerase 5'→3' cú cú cú
Exonuclease 3'→5' cú cú cú
Exonuclease 5'→3' cú khụng khụng
DNA polymerase người α β γ δ ε
Định vị nhõn nhõn ty thể nhõn nhõn Tỏi bản cú khụng cú cú cú Sữa chữa khụng cú khụng cú cú Chức năng Polymerase 5'→3' cú cú cú cú cú Exonuclease 3'→5' khụng khụng cú cú cú Exonuclease 5'→3' khụng khụng khụng khụng khụng Primase cú khụng khụng khụng khụng Kết hợp với PCNA* khụng khụng khụng cú cú
Mấu trượt (Processivity) thấp cao
Tổng hợp sợi ra chậm sửa cả hai dẫn đầu ra chậm
(1) Protein nhận biết và bỏm khởi điểm để từđú hỡnh thành nờn "phức hợp mở" (open complex). ỞE. coli, đú là protein dnaA.
(2) DNA gyrase mở cuộn DNA siờu xoắn trước mỗi chạc tỏi bản. (3) Helicase (ởE. coli, đú là protein dnaB) thỏo xoắn DNA sợi kộp tại mỗi chạc tạo thành cỏc vựng sợi đơn. Ở E. coli, nú cũng gọi là protein
dnaB hay protein rep.
(4) Protein SSB (single strand binding protein) bỏm vào cỏc vựng DNA sợi đơn do helicase tỏch ra, giữ cho tạm thời khụng dớnh trở lại và
nhờđú mỗi sợi đơn mới cú thể làm khuụn (template) cho tỏi bản.
(5) Primase tổng hợp mồi. ỞE. coli, nú cũn được gọi là protein dnaG. (6) Cỏc DNA polymerase xỳc tỏc chớnh cho việc tổng hợp DNA mới nhờ cú hoạt tớnh xỳc tỏc: polymerase 5'→3', một số cũn cú hoạt tớnh đọc sửa: exonuclease 3'→5'. ỞE. coli, đú là DNA polymerase III.
(7) DNA polymerase vừa cắt bỏ dần đoạn mồi đi trước nhờ hoạt tớnh cắt bỏ exonuclease 5'→3', vừa kộo dài đoạn Okazaki theo sau lấp chỗ trống nhờ hoạt tớnh polymerase 5'→3'. ỞE. coli, đú là DNA polymerase I. (8) DNA ligase hàn liền khe hở giữa cỏc đoạn Okazaki (DNA mới tổng hợp) bằng cỏch hỡnh thành liờn kết 3',5'-phosphodiester.
Hỡnh 5.5 Nhiều khởi điểm tỏi bản trờn một nhiễm sắc thể eukaryote.Ởđõy cũng cho thấy cỏc đầu mỳt (telomere) 5' khụng được tổng hợp đầy đủ.
Ởđõy chỳng ta cần lưu ý thờm một sốđiểm khỏc nhau về cỏc enzyme tỏi bản giữa hai nhúm prokaryote và eukaryote (xem Bảmg 5.1):
(i) Ở E. coli, cả ba loại protein dnaB, dnaC và dnaG hợp thành một phức hợp cú tờn là primasome (thể mở đầu); trong đú protein dnaC bỏm protein dnaB. Bảng 5.1 mụ tả cỏc đặc tớnh của cỏc DNA polymerase ởE. coli và người đại diện cho cỏc nhúm tương ứng, prokaryote và eukaryote. (ii) Tất cả cỏc DNA polymerase đều cần cú mồi với một nhúm 3'-OH tự do; chỳng xỳc tỏc tổng hợp chuỗi theo một hướng 5'→3' và chỉ một số enzyme này cú hoạt tớnh đọc sửa (proofreading activity) 3'→5'.
(iii) Khỏc với E. coli, cỏc tế bào người cú năm loại DNA polymerase, trong đú ba loại chịu trỏch nhiệm tỏi bản DNA nhõn là cỏc DNA
polymerase alpha, delta và epsilon. Polymerase δ chịu trỏch nhiệm chớnh cho tổng hợp sợi dẫn đầu (leading strand) và thậm chớ cả sợi ra chậm
(lagging strand). Polymerase α kết hợp với một RNA primase và được coi là cú cỏc hoạt tớnh cho tổng hợp một đoạn mồi RNA ngắn (ởE. coli là 10- 12 base). Cú điều khụng chắc chắn lắm khi núi về chức năng của polymerase α trờn sợi ra chậm. Vỡ dường như nú thiếu mất hoạt tớnh đọc sửa, nờn khụng thể tổng hợp DNA với độ chớnh xỏc cao và như vậy cú thể nú khụng phải là polymerase chớnh trong tổng hợp sợi ra chậm. Polymerase ε cú thể hoạt động như DNA polymerase I của vi khuẩn. Loại
khỏng nguyờn nhõn làm tăng sinh tế bào (proliferating cell nuclear antigen = PCNA) cú vai trũ trong cả tỏi bản lẫn sửa chữa. Một trong cỏc chức năng của nú là dựng làm nhõn tố trượt cho DNA polymerase δ và ε. PCNA giữ DNA polymerase với sợi khuụn để tổng hợp DNA nhanh. (iv) Ngoài ra cũn cú một số enzyme và protein đặc thự tham gia vào khõu kết thỳc tỏi bản, tổng hợp cỏc đầu mỳt (telomere) hoặc tham gia cắt nối trong quỏ trỡnh tỏi tổ hợp (xem ở phần sau).
3. Cơ chế tỏi bản DNA
Trong phần này, chỳng ta tỡm hiểu chủ yếu cơ chế tỏi bản ở vi khuẩn
E. coli và nờu một số vấn đề liờn quan eukaryote, đại diện là DNA người. 3.1. Giai đoạn khởi đầu của sự tỏi bản (initiation of replication)
Đối với nhiễm sắc thể E. coli, sự tỏi bản bắt đầu tại một khởi điểm đặc thự duy nhất gọi là Ori (Hỡnh 5.4). Trong khi đú, mỗi nhiễm sắc thể eukaryote cú nhiều khởi điểm tỏi bản hai hướng như thế (Hỡnh 5.5). Quỏ trỡnh diễn biến tại khởi điểm cho đến lỳc hỡnh thành hai chạc cú thể túm tắt (từ Kelman và O'Donnell 1994; xem cỏc Hỡnh 5.6 và 5.7) như sau:
(1) Cỏc protein bỏm khởi điểm dnaA được tổng hợp để bỏm Ori tạo ra cấu trỳc nucleoprotein chuyờn hoỏ của khởi điểm;
(2) Cấu trỳc này mở xoắn vựng DNA giàu AT để hỡnh thành "phức hợp mở" (open complex); và
(3) Hai phõn tử helicase dnaB chui vào phức hợp mở làm mở xoắn khởi điểm theo cả hai hướng, tạo thành hai chạc tỏi bản (replication fork). Khi cả hai sợi đơn của mỗi chạc được tỏch ra thỡ cỏc protein SSB bỏm vào. Nhờ vậy cỏc sợi đơn được dựng làm khuụn hiệu quả cho cỏc enzyme tỏi bản hoạt động.
Khởi đầu trong tỏi bản DNA là sự tổng hợp một đoạn mồi ngắn bởi primase (xem Hỡnh 5.4), mà ởE. coli là phức hợp primasome. Kớch thước đoạn mồi ở cỏc sinh vật thường khụng vượt quỏ 12 nucleotide. Ở E. coli,
theo kết quả nghiờn cứu của bà Okazaki và cs (1985), cỏc đoạn mồi dài 10-12 nucleotide. [Về số liệu này, một số cho rằng khoảng 5 nucleotide.]
(a) g ợp ạ ( ) 5’ 3’ 3’ 5’ trỡnh tựDNA khởiđiểm
bỏm vào của cỏc protein dnaA
A A A cỏc protein dnaA tụhọp DNA bịbiến tớnh bởi cỏc protein dnaA A A A A A A A A A A A A B C
cỏc protein dnaB và dnaC bỏm vào DNA sợiđơn
dnaB thỏo mởchuỗi xoắn kộp
(b) A A A A A A B C dnaB tiếp tục mởchuỗi xoắn kộp và thếchỗcỏc protein dnaA G
dnaG (primase) bỏm vào...
A A A A A A A B C G ...và tổng hợp mộtđoạn mồi RNA RNA primer (~5 nucleotide)
Hỡnh 5.6 Tiến trỡnh khởi đầu tỏi bản DNA ởE. coli. Mởđầu là sự bỏm vào
ori của cỏc protein dna A (a) cho đến khi tổng hợp đoạn mồi RNA đầu tiờn bởi primasome - phức hợp mởđầu gồm cỏc protein "dnaG + dnaC + dnaB" (b).
3.2. Giai đọan kộo dài (elongation)
Một khi primasome tổng hợp xong một mồi, đú là lỳc sự kộo dài chuỗi DNA mới bắt đầu. ỞE. coli, enzyme chủ chốt cho quỏ trỡnh này là DNA polymerase III hoàn chỉnh (holoenzyme), một phức hợp gồm mười polypeptide khỏc nhau. Mỗi phõn tử cho một sợi khuụn. Sự kộo dài trong suốt quỏ trỡnh tổng hợp DNA ởE. coli rừ ràng là cần tới một replisome
(thể tỏi bản) do kết hợp giữa primasome và DNA polymerase III hoàn chỉnh. Tốc độ tổng hợp trung bỡnh là 1.000 nucleotide mỗi giõy.
Hỡnh 5.7 Cơ chế tỏi bản nửa giỏn đoạn ở một chạc của DNA E. coli.
Sự tỏi bản DNA kiểu nửa giỏn đoạn (semi-discontinuous) xảy ra tại mỗi chạc tỏi bản của DNA E. coli như sau (Hỡnh 5.7):
y Trờn sợi khuụn dẫn đầu (3'→5'): Trước tiờn, enzyme primase hay primasome chỉ tổng hợp một đoạn mồi RNA với đầu 3'-OH tự do. Sau đú, enzyme hoàn chỉnh DNA polymerase III (replisome) bắt đầu kộo dài chuỗi DNA mới sinh trưởng theo chiều 5'→3' một cỏch liờn tục.
y Trờn sợi khuụn ra chậm (5'→3'): Sự kộo dài diễn ra khụng liờn tục dưới dạng cỏc đoạn Okazaki. Kớch thước trung bỡnh mỗi đoạn Okazaki ở
E. coli là 1.000 - 2.000 nucleotide (ở cỏc sinh vật núi chung là 100-1.000 nucleotide). Quỏ trỡnh này cú tớnh chu kỳ, đũi hỏi phải được "mồi húa" nhiều lần, với sự tham gia lần lượt của bốn enzyme sau đõy:
(i) primase tổng hợp một đoạn mồi RNA bổ sung với DNA; (ii) DNA polymerase III hoàn chỉnh kộo dài đoạn Okazaki;
(iii) DNA polymerase I vừa cắt bỏ dần từng nucleotide của đoạn mồi vừa lấp khoảng trống bằng cỏch kộo dài dần đoạn Okazaki theo sau nú; (iv) DNA ligase hàn liền khe hở cũn lại giữa hai đoạn Okazaki kề sỏt nhau bằng một liờn kết 3',5'-phosphodiester.
Quỏ trỡnh tổng hợp Okazaki trờn sợi khuụn ra chậm diễn ra theo chu kỳ hoạt động của bốn enzyme núi trờn, và nú diễn ra đồng thời với quỏ trỡnh tổng hợp liờn tục trờn sợi khuụn dẫn đầu của mỗi chạc tỏi bản.
Ở eukaryote, vai trũ của cỏc enzyme ở giai đoạn kộo dài nhưđó được đề cập ở trước: DNA polymerase δ chịu trỏch nhiệm tổng hợp sợi dẫn đầu, cũn DNA polymerase α (và thậm chớ cả pol δ) tổng hợp sợi ra chậm. Hỡnh 5.8 cho thấy sự hoạt động của cỏc protein và enzyme khỏc nhau
tại mỗi chạc tỏi bản của E. coli và của người.
5’3’ 3’
3’5’ 5’ protein Rep (helicase)
protein bỏm sợiđơn (SSB) B C G Primasome pol I pol III pol III DNA ligase
DNA gyrase –đõy là một topoisomerase II, cắt và nối lại DNA để đưa cỏc vựng siờu xoắn ngược phớa trước mỗi chạc
Hỡnh 5.8A Cỏc enzyme và protein tại mỗi chạc tỏi bản DNA E. coli.
5’3’ 3’ 3’ 5’ helicase SSB polα (hay polδ) DNA ligase topoisomerases I và II PCNA hoạt tớnh primase kết hợp với polα polδ Sợi dẫnđầu Sợi ra chậm hoạt tớnh exo 5’→3’ kết hợp với phức hợp polε
Hỡnh 5.8B Cỏc enzyme và protein tại mỗi chạc tỏi bản DNA người.
3.3. Giai đọan kết thỳc (termination)
Do đặc điểm cấu trỳc nhiễm sắc thể ở hai nhúm prokaryote và eukaryote là hoàn toàn khỏc nhau, đặc biệt là cấu trỳc cỏc đầu mỳt nhiễm sắc thể eukaryote được phỏt hiện gần đõy (hỡnh 5.9), nờn cơ chế kết thỳc tỏi bản của chỳng cũng khỏc nhau.
3.3.1. Vấn đề kết thỳc tỏi bản ởE. coli
Để hoàn thành cụng việc tỏi bản DNA, tế bào phải lấp đầy cỏc khoảng trống do cỏc RNA mồi bị cắt bỏđể lại. Đối với cỏc DNA mạch vũng như của vi khuẩn chẳng hạn, khụng cú vấn đề lấp tất cả cỏc khoảng trống bởi vỡ bao giờ cũng cú đầu 3' DNA khỏc nằm phớa trước dựng làm mồi. Thật
vậy, cả hai chạc tỏi bản được bắt đầu từ một khởi điểm duy nhất (ori), và di chuyển hầu như cựng tốc độ, theo hai hướng đối lập nhau xung quanh nhiễm sắc thể mạch vũng cho tới khi chỳng gặp nhau tại một điểm kết thỳc chung đối xứng với ori. Theo Bastia và cs (1997) cũng như nhiều tỏc giả khỏc, đõy là vựng chứa cỏc trỡnh tựđặc thự gọi là cỏc điểm kết thỳc tỏi bản (replication termini). Và tại cỏc trỡnh tựđặc thự này cú cỏc protein kết thỳc tỏi bản (replication terminator protein = RTP) bỏm vào và cỏc phức hợp protein-DNA này ngăn cản sự di chuyển của cỏc chạc tỏi bản theo cỏch phõn cực hoặc định hướng đặc thự. Sự ngừng lại của cỏc chạc tỏi bản tại vựng kết thỳc tạo nờn bước đầu tiờn trong quỏ trỡnh hoàn thành một vũng tỏi bản và sau đú, tỏch rời hai nhiễm sắc thể con một cỏch cú trật tự nhờ xỳc tỏc của topoisomerase IV.
3.3.2. Vấn đề kết thỳc tỏi bản ở eukaryote
Như chỳng ta đều biết, mỗi nhiễm sắc thể eukaryote chứa một phõn tử DNA sợi kộp mạch thẳng kết hợp với nhiều loại protein, cú cỏc đầu mỳt đặc trưng gọi là telomere. Một khi đọan mồi đầu tiờn trờn mỗi sợi được loại bỏ thỡ nú khụng cú cỏch nào để bự đắp lại khoảng trống đú, bởi vỡ DNA khụng thể nào nới rộng theo chiểu 3'→5', và cũng chẳng cú đầu 3' nằm phớa trước như trong cỏc DNA mạch vũng. Nếu quả thực như vậy thỡ cỏc sợi DNA sẽ ngắn bớt đi sau mỗi lần tỏi bản. Vậy cỏc tế bào eukaryote giải quyết vấn đề này như thế nào?
Cỏc kết quả nghiờn cứu đầu tiờn của Elizabeth Blackburn và cỏc đồng sự của bà đó giải đỏp cho vấn đề này (Hỡnh 5.10). Cỏc telomere khụng chứa cỏc gene; thay vỡ thế chỳng cú cấu trỳc đơn giản gồm những trỡnh tự ngắn (6-8 bp) lặp lại nối tiếp cả ngàn lần và đặc thự cho từng loài.
Chẳng hạn, ở Tetrahymena, một nhúm động vật nguyờn sinh cú lụng tơ, trỡnh tự này là (TTGGGG)n; ở Caenorhabditis: (CCCTCCC)n; ở bọn
Oxytrichia thuộc Euplotes: (CCCCAAA)n; v.v. Ở người và cỏc động vật cú vỳ là 5'-TTAGGG-3' được lặp lại khoảng 1.000-2.000 lần (theo Yakoob và cs 1999, khoảng biến thiờn phỏt hiện được trong cỏc tế bào ở cỏc giai đoạn khỏc nhau là 150-2.000 lần).
Cỏc đoạn lặp này được gắn thờm vào đầu 3' của cỏc sợi DNA, khụng phải bằng tỏi bản bỏn bảo toàn, mà bằng một enzyme cú tờn là telomerase. Nếu như telomerase khụng cho phộp một cơ chế tỏi bản bỏn bảo toàn, thỡ nú khụng thể sử dụng một sợi DNA làm khuụn cho sợi kia. Blackburn cho rằng đặc tớnh này là do một RNA nhỏ cú mặt trong chớnh telomerase. Thật vậy, telomerase là một ribonucleoprotein cú bản chất của một enzyme phiờn mó ngược (reverse transcriptase) ở chỗ, tổng hợp DNA từ
một khuụn RNA. Chẳng hạn, telomerase của Tetrahymena cú một RNA dài 160 nucleotide cú chứa trỡnh tự 3'-CAACCCCAA-5' làm khuụn cho tổng hợp cỏc đoạn lặp 5'-TTGGGG-3' trong cỏc telomere của nú (Hỡnh 5.10). Ở người, phõn tử RNA trong telomerase dài khoảng 450 nucleotide cú chứa trỡnh tự 3'-AAUCCC-5' (nằm trong đoạn ứng với vị trớ 46-56) làm khuụn cho sự tổng hợp cỏc đoạn lặp telomere 5'-TTAGGG-3' trờn cỏc sợi đơn cú đầu mỳt 3'. Sau đú, ở sợi đối diện, DNA polymerase cú thể hoàn thành việc tổng hợp "cỏc đầu mỳt khụng đầy đủ" (incomplete ends) trờn sợi đối diện sau khi đó được mồi húa bờn trong cỏc telomere đú; và cuối cựng đoạn mồi sẽ bị cắt bỏ.
Cỏc nghiờn cứu gần đõy cho thấy rằng: enzyme telomerase chỉ cú mặt trong cỏc tế bào mầm (germ cells), kể cả cỏc tế bào gốc của phụi
(embryonic stem cells); cỏc tế bào ung thư (cancer cells); và cỏc eukaryote
đơn bào như Tetrahymena thermophila. Trong khi đú, cỏc tế bào soma bỡnh thường của động vật cú vỳ khụng thấy cú telomerase.
Điều đú cho phộp lý giải tại sao cỏc tế bào mầm cũng như cỏc tế bào ung thư cú khả năng phõn chia gần như là vụ hạn; hay núi cỏch khỏc, telomerase và sự duy trỡ chiều dài telomere chớnh là chỡa khúa cho sự bất tử của tế bào. Ngược lại, hậu quả của sự vắng búng telomerase trong cỏc tế bào soma (do gene mó húa nú bất hoạt) là ở chỗ: cứ sau mỗi lần nguyờn phõn (mitosis), tất cả 92 telomere của cỏc tế bào soma người đồng loạt mỗi cỏi bị mất đi chừng 100 cặp base, nghĩa là khoảng 16 đoạn lặp TTAGGG. Theo lý thuyết, với tốc độ này, sau 125 lần nguyờn phõn cỏc telomere sẽ biến mất hoàn toàn. Trờn thực tế, cỏc thớ nghiệm khỏc nhau kể từ khỏm phỏ đầu tiờn của Leonard Hayflick vào đầu thập niờn 1960 cho đến nay (Greider và Blackburn 1996; Hayflick 1997; Shay và cs 2004; ...) đó xỏc nhận rằng: chỉ sau khỏang 30-50 lần nguyờn phõn, cỏc tế bào soma mất hẳn khả năng phõn chia và bước vào giai đoạn lóo húa (senescence) và chết tự nhiờn. Cỏi đú được gọi là giới hạn Hayflick (Hayflick limit). Chớnh quỏ trỡnh rỳt ngắn telomere theo thời gian (nghĩa là số lần nguyờn phõn) như thế khiến người ta liờn tưởng tới sự tồn tại của cỏi gọi là "đồng hồ di truyền cho sự lóo húa" (genetic clock for aging) và bắt đầu tiến hành cỏc nghiờn cứu về "hiệu ứng vị trớ telomere" (telomere position effect = TPE) (Borek 2002). Đú là lý do tại sao cỏc tế bào soma cú số lần phõn chia hữu hạn trước khi chỳng chết và cũng là lý do tại sao tất cả chỳng ta cũng như mọi sinh vật đều phải già lóo và chết đi. Như thế, cỏi chết tất yếu trờn phương diện sinh học, cỏi chết tự nhiờn của thõn xỏc đó được lý giải khỏ rừ ràng và đầy đủ. Từ cỏc nghiờn cứu này cũng đó mở ra triển vọng to lớn cho liệu phỏp ung thư (cancer therapy) cũng như vấn đề
lóo húa và bệnh tật phỏt sinh từ đú ở con người (Greider và Blackburn 1996;Yakoob và cs 1999; Borek 2002; Shay và cs 1998, 2004).
(a) (b)
Hỡnh 5.9 (a) Ảnh chụp cho thấy cỏc đầu mỳt nhiễm sắc thể - telomeres cú màu vàng đặc trưng, và (b) sơđồ minh họa tổ chức của telomere ở người.
Kộo dài
Chuyển dịch
Kộo dài
Hỡnh 5.10 Mụ hỡnh của Carol Greider về cơ chế tổng hợp cỏc đoạn lặp telomere trờn sợi giàu G nhờ telomerase ở Tetrahymena. Từ đõy cú thể hỡnh dung cỏc bước tiếp theo: lấp khoảng trống trờn sợi đối diện giàu C được thực hiện bởi primase và DNA polymerase, và cuối cựng là cắt bỏđoạn mồi.
4. Tỏi bản của cỏc bộ gene RNA
4.1. Đặc điểm tỏi bản của cỏc bộ gene RNA virus
Ở cỏc virus cú bộ gene RNA, phương thức tỏi bản của chỳng rừ ràng là