2.1. Qui trình sản xuất dự kiến
Phụ phẩm cá tra đã xử lí nhiệt tách béo
Phối trộn với nước (1:1) Tách xương và tạp chất Nước vụn cá tra Thủy phân Dịch đạm Phân bón lá Dịch đạm dạng lỏng (25%) Bao gói Ép viên
17 Xương và tạp chất
Chế phẩm vi khuẩn, muối, pH 15 ngày
Bổ sung khoáng vi lượng và trung lượng Chlorine (1%)
Hổn hợp 75% (75%than bùn và 25%bùn đáy ao)
Thành phẩm
Áp dụng phương pháp bổ sung muối một đợt với mục đích hạn chế sự xâm nhập vi khuẩn tạp, đồng thời duy trì mật số vi khuẩn Bacillus subtilis và tăng khả năng hoạt động của enzyme thủy phân protein. Việc cho muối một lần quyết định đến thời gian và hiệu suất thủy phân protein của phụ phẩm cá tra, pH của hỗn hợp dịch thủy phân ở điều kiện tự nhiên. Kết thúc quá trình thủy phân khi đạm amin không còn tăng nữa, 7 ngày lấy mẫu một lần.
2.2. Bố trí thí nghiệm 1
- Mục đích: Xác định khoảng bố trí thích hợp giữa các nhân tố sau cho quá trình thủy phân đạt hiệu quả cao nhất nhất.
-Cách tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện ngoài trời và bố trí trong 24 thùng composite với dung tích 10 lít đặt thành hai dãy song song với nhau tại cơ sở sản xuất chế phẩm sinh học ở Cần Thơ. Mỗi thùng chứa hỗn hợp dịch thủy phân gồm phụ phẩm cá tra và nước được phối trộn theo tỷ lệ 1:1 về khối lượng, tỷ lệ chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis và muối bổ sung tính theo tổng khối lượng của hỗn hợp dịch thủy phân. Các thùng composit được ký hiệu như sau: nghiệm thức 1.1, nghiệm thức 1.2, những nghiệm thức còn lại cũng được ký hiệu tương tự để tiện cho việc theo dõi mẫu và kiểm tra trong quá trình thực hiện thí nghiệm.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân tố với hai lần lặp lại. Nhân tố A là vi khuẩn với 4 mức độ:
A1 = 0% A2 = 0,5% A3 = 1% A4 = 1,5% Nhân tố B là muối với 3 mức độ:
B1 = 2% B2 = 4% B3 = 6%
Sơ đồ bố trí:
Nguyên liệu ( phụ phẩm cá tra) Phối trộn
Sơ đồ bố trí: Nguyên liệu ( phụ phẩm cá tra)
Phối trộn A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B1 B2 B3 B1 B2 B3 B1 B2 B3 Lên men 24 ngày Dịch đạm ... Sản phẩm Hình 4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 Hình 3: Quy trình sản xuất dự kiến
2.3. Kết quả thí nghiệm 1
Kết quả thí nghiệm được xử lí bằng chương trình thống kê Statgraphics Plus 3.0, với tỷ lệ 1 kg vụn cá tra bổ sung thêm 1 kg nước, sau 21 ngày thủy phân cho kết quả tốt nhất ở ngày thứ 14 với tỷ lệ muối 4% và tỷ lệ chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis là 1 %.
2.4. Bố trí thí nghiệm 2
Mục đích: Xác định tỷ lệ vi khuẩn, muối, pH sau cho dịch thủy phân tạo ra hàm lượng đạm amin cao nhất trong thời gian lên men ngắn nhất.
Cách tiến hành: Trên cơ sở tối ưu của thí nghiệm 1 ta tiến hành thí nghiệm 2, được bố trí theo thể thức thừa số gồm ba nhân tố ( pH, chế phẩm vi khuẩn, muối ) mỗi nhân tố có ba tỷ lệ với hai lần lặp lại. Tổng số nghiệm thức là 27 nghiệm thức, gồm 54 mẫu. Ở điều kiện ngoài trời, thí nghiệm được bố trí trong 54 thùng composite với dung tích 10 lít đặt thành hai dãy song song với nhau tại cơ sở sản xuất chế phẩm sinh học ở Cần Thơ. Mỗi thùng chứa hỗn hợp dịch thủy phân gồm phụ phẩm cá tra và nước được phối trộn theo tỷ lệ 1:1 về khối lượng, tỷ lệ chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis và muối bổ sung tính theo tổng khối lượng của hỗn hợp dịch thủy phân và điều chỉnh pH. Các thùng composit được ký hiệu như sau: nghiệm thức 1.1, nghiệm thức 1.2, những nghiệm thức còn lại cũng được ký hiệu tương tự để tiện cho việc theo dõi mẫu và kiểm tra trong quá trình thực hiện thí nghiệm.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên ba nhân tố với hai lần lặp lại. Nhân tố C là vi khuẩn với 3 mức độ
V1 = 0% V2 = 1,5% V3 = 3% Nhân tố D là pH với 3 mức độ
H1 = 5,0 H2 = 6,0 H3 = 7,0 Nhân tố M là muối với 3 mức độ
M1 = 3% M2 = 7% M3 = 10%
19
Sơ đồ bố trí: Nguyên liệu ( phụ phẩm cá tra)
... Phối trộn V1 V2 V3 H1 H2 H3 H1 H2 H3 H1 H2 H3 M2 M2 M2 M2 M2 M2 M2 M2 M2 M1 M3 M1 M3 M1 M3 M1 M3 M1 M3 M1 M3 M1 M3 M1 M3 M1 M3 Lên men Dịch đạm ... Sản phẩm Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiện 2
Do ở thí nghiệm 1 số liệu thu được có nhiều biến động nên ở thí nghiệm 2 phụ phẩm cá tra sau khi xử lí nhiệt tách béo được phối trộn với nước theo tỷ lệ 1 : 1, rồi tiến hành tách bỏ xương và tạp chất bằng rổ inox, thu được hỗn hợp dịch thủy phân. Bổ sung muối và chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis vào hỗn hợp dịch thủy phân thu được sau khi đã tách tạp chất và xương với tỷ lệ chế phẩm vi khuẩn bổ sung và tỷ lệ muối bổ sung tính theo tổng khối lượng của hỗn hợp dịch thủy phân thu được. Áp dụng phương pháp bổ sung muối một đợt với tỷ lệ tương đối thấp 3%, 7%, 10%, pH của dịch thủy phân được điều chỉnh theo đúng thông số bố trí của các nghiệm thức, hóa chất dùng điều chỉnh pH là NaOH 0,1N và HCl 0,1N. Theo dõi quá trình thủy phân đến khi đạm amin không còn tăng nữa.
2.5. Cách lấy mẫu
Mẫu được khuấy đều, sau đó dùng giá lấy mẫu cho vào hủ nhựa (hủ dùng làm sữa chua), 5 ngày lấy mẫu 1 lần. Mẫu được bảo quản ở 50C và tiến hành phân tích.
2.6. Các phương pháp phân tích kiểm nghiệm hóa lý
Định lượng đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldahl (phụ chương A). Định lượng đạm formol bằng phương pháp chuẩn độ (phụ chương A).
Định lượng đạm amoniac bằng phương pháp cất kéo hơi nước (phụ chương A). Định lượng đạm amin (phụ chương A).
Xác định trọng lượng khô (phụ chương A).
Định lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet (phụ chương A).
Xác định hàm lượng Nitrate bằng phương pháp so màu ( phụ chương A)
2.7. Các phương pháp phân tích vi sinh vật
* Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí ( PCA : Plate Count Agar)
Tryptone 5g
Glucose 1g
Cao nấm men 2,5g
Agar 15g
Nước cất thêm vào cho vừa đủ 1000ml, đem thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút, điều chỉnh pH 6,8 đến 7,2
* Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn thủy phân protein
( TSA:Trypticase Soja Agar)
Casein 15,0g
Sojamehl 5,0g
Natriumchlorid 5,0g
Agar 15,0g
Nước cất thêm vào cho vừa đủ 1000ml, đem thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút, điều chỉnh pH 6,8 đến 7,3.
Cân chính xác từng phần của hai loại môi trường để điều chế được 1000ml môi trường.
* Phân phối môi trường
Môi trường sau khi đã thanh trùng để nguội khoảng 45 – 500C, tiến hành đổ vào các đĩa Petri. Chú ý khi đổ các đĩa Petri được xếp cao từ 3 – 4 đĩa và mở nắp từ dưới lên đồng thời đổ khoảng 15ml/đĩa, sau đó để yên cho vào tủ cấy vô trùng cho đặc agar.
Nếu tiến hành nuôi cấy ngay thì ta phải lật úp đĩa và bật quạt thổi của buồng cấy để làm khô nước trên bề mặt agar. Nếu không nuôi cấy ngay ta để các đĩa thạch trong bao nylon và bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ 50C.
*Chuẩn bị dung dịch pha loãng( dung dịch Salin)
Cân chính xác pepton 0,5g và NaCl 4g cho vào bình định mức và thêm nước cất vừa đủ 500ml rồi khuấy thật kỹ.
Chiết 500ml dung dịch ra hai bình tam giác có dung tích 500ml mỗi bình chứa 250ml rồi đem thanh trùng cùng với môi trường đã chuẩn bị ở trên.
*Cách pha loãng
Việc pha loãng mẫu được thực hiện bằng dung dịch salin
Dung dịch Salin được đựng trong chai thủy tinh với dung tích 12ml và đựng sẵn 9ml/1 chai đã khử trùng. Trước khi pha loãng ta phải Voltex ống chứa mẫu để trộn đều mẫu. Dùng pipet hút 1ml mẫu đã Voltex cho vào ống pha loãng chứa 9ml dung dịch Salin theo sơ đồ, sau khi Voltex kỹ sẽ được độ pha loãng 1/10 tức là 10-1, mẫu này được Voltex và tiếp tục dùng ống hút khác hút 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10-1 cho vào chai chứa salin thứ hai ta có mẫu ở độ pha loãng 10-2, tiếp tục như thế ta có mẫu ở các độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6,….
Số lượng vi sinh vật trong mẫu càng lớn thì độ pha loãng càng cao. Khi pha loãng mẫu ta phải dùng ống hút riêng cho mỗi độ pha loãng.
Mẫu được pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân 1/10,1/100,1/1000,… Mỗi bậc pha loãng là 1/10 ( Trần Linh Phước, 2002)
* Phương pháp cấy vi sinh vật trên đĩa Petri
Sau khi khử trùng toàn bộ các dụng cụ (đầu côn, môi trường, dung dịch pha loãng, đĩa Petri…) ở nhiệt độ 1210C, thời gian 15 phút. Dùng búp lông đánh số ký hiệu mẫu lên mặt trên của đĩa petri
Trước khi tiến hành cấy, buồng cấy và dụng cụ phải được khử trùng cẩn thận bằng đèn cực tím với thời gian 30 phút.
Dùng bút lông đánh số ký hiệu mẫu lên mặt trên của đĩa petri
Dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu đã pha loãng cho vào đĩa Petri, lặp lại trình tự này với các dịch pha loãng tiếp theo, mỗi mẫu phải cấy vi sinh vật ở ba độ pha loãng liên tiếp sau cho số khuẩn lạc xuất hiện dự kiến khoảng 25 đến 300 khuẩn lạc mới phù hợp.
Khi môi trường đạt nhiệt độ 450C ± 0,50C tiến hành rót khoảng 15ml vào đĩa petri đồng thời trộn cẩn thận mẫu cấy với môi trường và để yên cho hỗn hợp đông đặc.
Sau khi các đĩa đã đông đặc hoàn toàn lật úp lại đem vào ủ ở 370C ( vi khuẩn thủy phân protein) và 320C ± 0,50C ( tổng vi khuẩn hiếu khí ) thời gian ủ khoảng 12 đến 24h.
* Đếm và xác định mật số vi khuẩn
Đếm tất cả số khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa Petri sau khi ủ khoảng 12 đến 24h bằng thiết bị đếm. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 đến 300 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu được tính như sau (Trần Linh Thước, 2003)
∑C A (CFU/g hay CFU/ml) =
( n1 + 0,1n2) d Trong đó:
A: Số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu.
∑C : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa Petri đã chọn. n1 : Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ 1.
n2 : Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ 2. d : Độ pha loãng tương ứng.
3. Thử nghiệm phân trên hẹ 3.1. Chuẩn bị thí nghiệm
Phân tích thành phần dinh dưỡng cơ bản của đất ở ruộng thí nghiệm. Chuẩn bị đất trồng, hẹ giống...
23
* Phối chế phân bón lá ( dịch đạm thủy phân) thử nghiệm:
Phối trộn dịch đạm thủy phân với các chất đều hòa sinh trưởng, vi lượng và trung lượng ( tính theo các thành phần phân bón lá HVP 601S Super bội thu của công ty cổ phần dịch vụ thương mại TP.HCM đem sử dụng trên ruộng thí nghiệm) .
* Phối chế phân dạng viên ( dịch đạm thủy phân) thử nghiệm:
1kg hỗn hợp ( 75% than bùn và 25% bùn đáy ao) + 250ml dịch đạm (25% dịch đạm)
3.3.2. Thành phần hoá học phân bón
3.2. Phân bón lá HVP 601.S Super bội thu vàng
Do công ty cổ phần dịch vụ kỹ thuật TP. HCM, 02 Tăng Nhơn Phú, Phường phước Long B, Q9. TP HCM
*Thành phần
60g N ; 60g P2O5 ; 40g K2O, acid humic: 1,5%, Mg :500mg/ lít; Mo: 200mg/lít ,Zn: 100mg/lít, pH: 7-8. Hạn sử dụng: 24 tháng, dung tích 1lít.
3.3. Phân bón HVP dạng viên
Do công ty cổ phần dịch vụ kỹ thuật TP. HCM, 02 Tăng Nhơn Phú, Phường phước Long B, Q9. TP HCM
Hình 8: Chuẩn bị đất trồng rau Hình 9 : Hẹ mới trồng
Hình 10: Phân bón lá dịch đạm thủy phân Hình 11: Phân bón lá HVP 601S bội thu vàng
Hình 12 : Phân bón dạng viên dịch đạm thủy phân Hình 13 : Phân bón HVP Organic Organic
* Thành phần
N: 9% - P2O5: 4% - K2O: 4%. Vi lượng sinh học: Ca: 150 ppm, Mg: 100 ppm, S: 600 ppm, Cu: 30 ppm, Re: 50 ppm, Zn: 50 ppmm, Mn: 40 ppm, B: 300 ppm, Mo: 50 ppm, I: 50 ppm.
3.4. Phân bón lá dịch đạm thủy phân
50g N ; 40g P2O5 ; 40g K2O, Mg : 423mg/ lít; Mo: 190mg/lít, Zn: 420mg/lít, Cu : 127mg/lít, Ca: 39mg/lít, pH: 7-8.
3.5. Phân bón dạng viên dịch đạm thủy phân
45g N ; 35g P2O5 ; 35g K2O, Mg : 3357mg/ lít; Cu: 190mg/lít, Mo: 220mg/lít ,Zn: 977mg/lít, pH: 7-8.
3.6. Các loại phân khác
Phân Urê :Nitrogen 46,3% (Đạm Phú Mỹ) Phân NPK :20 – 20 – 15 ( Hiệu con cò đứng) Phân DAP (Indonesia )
Phân bón lá : HVP 601S Super bội thu ( Công ty cổ phần dịch vụ thương mai TP.HCM) Phân bón dạng viên: HVP Organic ( Công ty cổ phần dịch vụ thương mai TP.HCM).
3.7. Bố trí thí nghiệm 3
Thí nghiệm được bố trí khối hoàn toàn ngẫu nhiên, với 7 nghiệm thức, 4 lần lặp lại. REP.I REP. II REP.III REP. IV
NT1 NT4 NT1 NT2 NT3 NT2 NT6 NT4 NT5 NT6 NT3 NT7 NT7 NT5 NT7 NT5 NT4 NT1 NT5 NT3 NT6 NT7 NT2 NT6 NT2 NT3 NT4 NT1
Hình 14: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng phân đến phát triển cây hẹ * Ghi chú:
NT: Nghiệm thức
NT1 : Bón Urê và DAP tỷ lệ 1: 2.55 (nghiệm thức đối chứng) NT2 : Phân HVP 601S Super bội thu vàng
NT3 : Phân bón lá dịch đạm
NT4:Bón NPK 20-20-15 ( Con cò đứng) NT5: Phân Urê 46,3% Nitrogen (Đạm Phú Mỹ) NT6: Phân bón dạng viên (dịch đạm)
NT7: Phân bón dạng viên HVP Organic
3.8. Cách tiến hành
* Phân tích thành phần dinh dưỡng cơ bản của đất ở ruộng thí nghiệm
- Cách lấy mẫu: Trên ruộng thí nghiệm, ta tiến hành chọn ngẫu nhiên 10 điểm, mỗi
điểm lấy một mẫu, trộn đều 10 mẫu lại rồi lấy khoảng 300g đem phân tích. Lấy mẫu bằng cách lấy một lớp mỏng từ mặt xuống sâu 3 cm.
- Mẫu đất được phân tích tại phòng thí nghiệm Trường Đại học An Giang.
Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng cơ bản của đất ở ruộng thí nghiệm như sau: Đạm tổng số: 0,01%, Lân tổng số: 0,07%, chất hữu cơ: 1,38%, pH ly trích bằng nước: 5,24, pH ly trích bằng dung dịch KCl: 4,22 (kết quả trung bình của ba lần lặp lại).
Từ kết quả phân tích trên nói lên được: Đất ở ruộng thí nghiệm thuộc dạng đất rất nghèo dinh dưỡng, có tính acid, không thuận lợi lắm cho cây trồng phát triển, nếu không được bổ sung thêm dinh dưỡng một cách hợp lí.
* Phối trộn phân để tưới và bón ( tất cả các nghiệm thức cùng hàm lượng đạm)
Bón phân đối chứng theo nông dân ( NT1)
Tưới lần 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: Dùng 6,5g Urê + 16,6g DAP pha với 8lít nước sạch/lô (tỷ lệ Urê và DAP là 1:2,55).
Bón phân bón lá HVP 601S Super bội thu vàng ( NT2): Dùng 40 ml pha với 8lít nước sạch/lô.
Bón phân bón lá dịch đạm (NT3 ): Dùng 90ml pha với 8lít nước sạch/lô. Bón phân NPK 20-20-15 (NT4): 30g pha với 8lít nước sạch/lô.
Bón phân Urê (NT5) : 13,1g pha với 8 lít nước sạch/lô. Bón phân dạng viên dịch đạm ( NT6) :2,0 kg/ lô bón lót. Bón phân dạng viên HVP Organic (NT7) : 0,64kg/lô bón lót.
3.9. Cách trồng rau hẹ
Chuẩn bị đất trồng: Đất trồng được làm sạch cỏ, cuốc xới cho tươi xốp, phơi đất 15 ngày, lên liếp kích thước: dài 10m, rộng 1.0m, cao 0,5m
Xử lí giống: Trồng bằng thân củ chứ không trồng bằng hạt. Hẹ giống sau khi mua đem về cắt bớt rễ, củ già, rồi đem trồng.
Cách trồng: Mỗi liếp trồng 6 hàng, khoảng cách giữa các hàng là 1,6cm, cây cách cây là 1,4cm. Mỗi lô (khối) 1,0m2, trồng 42 bụi hẹ, mỗi bụi 12 cây.
3.10. Chăm sóc
Tưới nước: Mỗi ngày tưới nước một lần vào sáng khoảng 7 - 8 giờ, tưới ướt đều trên liếp trồng hẹ, làm sạch cỏ.
Tưới phân: Tất cả các loại phân đều sử dụng cùng nồng độ, tính theo nồng độ đạm là 6%.
Tưới định kỳ 5 ngày một lần, bắt đầu tưới phân khi hẹ trồng được 20 ngày.
3.11. Đo chiều cao cây rau hẹ
Bắt đầu đo chiều cao cây hẹ khi đã bén rể (20 ngày sau khi trồng) Chiều cao cây hẹ được đo định kỳ 10 ngày một lần.