3. Đối t−ợng, địa điểm, nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.4.Ph−ơng pháp nghiên cứu 1 Các ph−ơng pháp tiến hành:
3.4.1. Các ph−ơng pháp tiến hành:
Các ph−ơng pháp điều tra ngoài sản xuất: Chúng tôi tiến hành điều tra các thông tin về khoai tây KT2 nh−:
- Tình hình sản xuất trên đồng ruộng - Diện tích trồng qua các vụ.
- Năng suất qua các vụ trồng.
- Chất l−ợng củ giống trong thời gian bảo quản (trọng l−ợng củ, tỷ lệ nảy mầm…)
- Tình hình nhiễm bệnh của cây trên đồng ruộng: đánh giá tình hình nhiễm bệnh của cây trên đồng ruộng theo mô tả triệu chứng bệnh virus khoai tây ở các tài liệu Bệnh cây nông nghiệp (Vũ Triệu Mân)[110], ứng dụng công
nghệ cao sản xuất giống khoai tây sạch bệnh (Nguyễn Quang Thạch và CS)[21].
Kiểm tra độ sạch virus bằng test Elisa: Chúng tôi tiến hành lấy mẫu trên đồng ruộng khoai tây ở huyện Quế Võ - Bắc Ninh theo ph−ơng pháp 5 đ−ờng chéo góc sau đó tiến hành Test Elisa tại trung tâm khảo kiểm nghiệm giống cây trồng trung −ơng.
Quy trình test ELISA:
B−ớc 1: Cân 0,05 g mô lá, nghiền trong 500àl đệm cacbonat buffer bằng chày và cối sứ.
B−ớc 2: Lấy 100àl dung dịch của các mẫu cho vào hai giếng của bản ELISA. Sau đó ủ qua đêm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 60C.
B−ớc 3: Rửa bản ELISA 3 lần trong đệm PBS - T (Phosphate Buffer - Saline - Tween), mỗi lần 3 phút; hai lần bằng n−ớc cất, mỗi lần 2 phút.
B−ớc 4: Nghiền dịch cây khoẻ trong đệm PBS - T theo tỷ lệ 1:20. Hoà kháng huyết thanh trong dịch cây khoẻ, rồi nhỏ 100àl dịch kháng huyết thanh/ giếng. ủ bản ELISA trong một giờ.
B−ớc 5: Hoà kháng thể đặc hiệu trong đệm PBS - T theo tỷ lệ 1/10000, nhỏ 100àl dịch kháng thể đặc hiệu/giếng, ủ 2h trong hộp ẩm.
B−ớc 6: Rửa bản nh− b−ớc 2
B−ớc 7: Hoà chất nền NPP trong đệm (đệm Subtrate). Nhỏ 100àl dịch chất nền trên 1 giếng, ủ bản trong hộp ẩm đặt trong tối 30 - 60 phút ở nhiệt độ phòng.
B−ớc 8: Dừng phản ứng bằng NaOH 3M.
Ph−ơng pháp tách đỉnh sinh tr−ởng:
Cây khoai tây đã vô trùng đ−ợc l−u giữ trong các bình thuỷ tinh đ−ợc lau sạch bằng cồn 700 sau đó đ−a và buồng vô trùng.
Dùng panh vô trùng gắp cây ra khỏi bình sau đó dùng kéo vô trùng cắt bỏ rễ cây.
Các đỉnh ngọn đ−ợc đặt d−ới kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại 30 lần để quan sát và tiến hành các thao tác tiếp theo.
Cắt bỏ lá trẻ nhất h−ớng về đỉnh sinh tr−ởng. Cắt bỏ lá nguyên thuỷ lớn nhất.
Cắt bỏ đôi lá nguyên thuỷ trẻ nhất còn lại, sau khi cắt xong lá nguyên thuỷ ở đỉnh lộ ra với phần lồi của mô phân sinh đỉnh.
Mô phân sinh đỉnh đ−ợc tách và cấy vào môi tr−ờng thích hợp. Để cắt cắt đ−ợc mô phân sinh đỉnh đòi hỏi phải có dao tách thích hợp để đạt đ−ợc mô cấy có kích th−ớc cần thiết.
Các ph−ơng pháp nuôi cấy in vitro: Sử dụng các ph−ơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật trên môi tr−ờng MS với 2,5% đ−ờng sacaroza, 6,5g agar với thí nghiệm 6 và nuôi cấy mô tế bào thực vật trên môi tr−ờng MS với 20% sacaroza trên nền môi tr−ờng lỏng không có agar.
Tất cả các môi tr−ờng nuôi cấy đều đ−ợc chỉnh pH = 5,74 bằng máy đo pH, NaOH và HCl. Môi tr−ờng đ−ợc hấp vô trùng ở 120oc trong vòng 20 phút.
Điều kiện phòng nuôi cấy: Nhiệt độ phòng nuôi 20 - 22oc, với quang chu kỳ chiếu sáng 16h chiếu sáng, 8h tối, c−ờng độ ánh sáng 3000 lux, ẩm độ 70%.
Trong các thí nghiệm tẩy sạch virus GA3 đ−ợc bổ xung trong buồng cấy vô trùng khi môi tr−ờng đã đ−ợc hấp vô trùng.