3.4.2.1. Chuẩn bị hỗn dịch hồng cầu gà 0,5%
* Phương pháp lấy máu:
Dùng bơm tiêm 5ml hút sẵn 1ml (10% thể tích) dung dịch chống đông Natri citrate 5%. Sát trùng, sau đó tiến hành lấy máu ở tĩnh mạch cánh gà. Cho máu vào ống nghiệm.
* Rửa hồng cầu:
Ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút, trong 15 phút, đổ bỏ huyết tương, cho thêm nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào hồng cầu, lắc đều. Ly tâm như trên 3 - 4 lần để rửa hồng cầu. Sau lần ly tâm cuối bỏ nước ở trên.
* Pha hồng cầu 0,5% (sử dụng trong phản ứng HA và HI):
Dùng Micropipet hút 1ml hồng cầu đã rửa trên cho vào ống thuỷ tinh có sẵn 199ml PBS, lắc đều được hỗn dịch hồng cầu 0.5%.
Dung dịch hồng cầu 0,5% có thể giữ được trong khoảng 1 tuần ở 40C. Hồng cầu dung huyết phải loại bỏ.
3.4.2.2. Chuẩn bị huyết thanh
Cách lấy mẫu: Dùng syringer lấy 1ml máu ở tĩnh mạch cánh cho vào ống eppendoft, để nghiêng ống 450, để ở nhiệt độ phòng hoặc tủ lạnh 40C (1 đến 2 giờ) cho máu đông, sau đó ly tâm chắt huyết thanh. Nếu không sử dụng huyết thanh ngay thì bảo quản ở 40C trong vòng 1 tuần, nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở -200C cho đến khi thực hiện phản ứng.
Xử lý huyết thanh: Đối với huyết thanh của một số loại gia cầm như: gà, chim, chim cút có thể không cần xử lý, vì mức độ thấp hoặc không phát hiện được ức chế không đặc hiệu. Nhưng đối với huyết thanh của thủy cầm (vịt, ngan, ngỗng...) thì trước khi thực hiện phản ứng HI cần phải được xử lý để loại trừ khả năng ức chế không đặc hiệu và hiện tượng ngưng kết giả. Vì trong huyết thanh của các loại gia cầm này có các phần tử không phải là kháng thể (ví dụ: acid sialic) nhưng có khả năng bám vào các điểm tiếp nhận của hồng cầu gây hiện tượng ngưng kết hồng cầu giả, làm phản ứng ngăn trở không đặc hiệu và kết quả trong phản ứng chẩn đoán bệnh cúm sai lệch.
Có nhiều phương pháp xử lý huyết thanh khác nhau như phương pháp sử dụng enzyme phá hủy điểm tiếp nhận (RDE), phương pháp hấp phụ hồng cầu
đặc (hồng cầu 10%). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp xử lý bằng nhiệt.
Phương pháp xử lý như sau: Huyết thanh trước khi làm phản ứng đem ủ ở nhiệt độ 560C trong 30 phút.
3.4.2.3. Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)
Cho 1 ml PBS vào lọ kháng nguyên đông khô lắc trộn đều để hoàn nguyên kháng nguyên. Sau đó thực hiện phản ứng HA để chuẩn độ kháng nguyên. Trên cơ sở kết quả của phản ứng HA pha kháng nguyên làm việc bằng 4 đơn vị HA.
* Phản ứng HA:
Cho 25µl PBS vào các giếng từ A1 - A12, B1 - B12. Cho 25µl kháng nguyên cúm gia cầm vào giếng A1, B1.
Pha loãng kháng nguyên bằng cách dùng micropipet trộn đều và chuyển 25µl từ giếng A1, B1 sang giếng A2, B2 và tuần tự đến giếng A11, B11 thì bỏ đi 25µl. Các giếng A12, B12 dùng để đối chứng (gồm hồng cầu và PBS).
Thêm 25µl hồng cầu 0,5% vào tất cả các giếng, lắc nhẹ. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Đọc kết quả: Hiệu giá của kháng nguyên được tính ở độ pha loãng cao nhất mà vẫn còn hiện tượng ngưng kết hồng cầu.
- Pha kháng nguyên làm việc 4 đơn vị HA: Lấy hiệu giá HA của kháng nguyên nhân với 4 ta có tỷ lệ để pha kháng nguyên 4 HA.
Ví dụ: Hiệu giá HA của kháng nguyên là 1/256 thì ta pha kháng nguyên đó với tỷ lệ 1/64 (1/256 x 4 = 1/64) để được kháng nguyên 4HA.
- Kiểm tra kháng nguyên làm việc 4 đơn vị HA:
Yêu cầu kháng nguyên 4HA dùng cho phản ứng HI phải chuẩn, kết quả mới chính xác và không bị sai lệch. Vì vậy, sau khi pha, kháng nguyên 4HA phải được chuẩn độ lại. Các bước tiến hành như sau:
Cho 25µl PBS vào các giếng từ A1 – A5, B1 – B5.
Cho 25µl kháng nguyên 4HA đã pha vào các giếng A1, B1.
Pha loãng kháng nguyên theo cấp số 2 từ hàng A1, B1 đến hàng A4, B4 rồi bỏ đi 25µl; A5 và B5 là các giếng đối chứng (gồm hồng cầu và PBS).
Thêm 25µl hồng cầu 0,5% vào tất cả các giếng A1 – A5, B1 – B5, lắc nhẹ. Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Kháng nguyên đạt 4HA nếu ngưng kết hồng cầu đến giếng thứ 2. Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 là kháng nguyên đặc nên cần phải thêm PBS, nếu chỉ ngưng kết đến giếng thứ 1 là kháng nguyên loãng nên cần phải thêm kháng nguyên đậm đặc vào. Sau đó tiến hành chuẩn độ lại kháng nguyên 4HA theo các bước như trên.
3.4.2.4. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Cho 25µl PBS vào tất cả các giếng của đĩa 96 giếng (trừ A1-H1).
Cho 50µl huyết thanh cần kiểm vào tất cả các giếng của cột đầu tiên (A1-H1). Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 bằng cách dùng micropipet trộn đều và chuyển 25µl huyết thanh từ cột 1 sang cột 2 và tuần tự đến cột 11 thì bỏ đi 25µl cuối cùng.
Cho 25µl kháng nguyên 4HA vào tất cả các giếng từ cột 1 đến cột 11. Thêm 25µl PBS vào cột đối chứng dương (cột 12): gồm hồng cầu và PBS. Lắc đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.
Cho 50µl dung dịch hồng cầu 0,5% vào tất cả các giếng, lắc đều. Để đĩa ở nhiệt độ phòng 30 phút.
Đọc kết quả:
Kết quả dương tính (+) khi hồng cầu tụ ở đáy giếng. Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà vẫn còn hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu.
Kết quả âm tính (-) nếu có hiện tượng ngưng kết hồng cầu ở đáy giếng.