PPGK1 bởi một trong những bản sao di truyền của nĩ
Cải thiện tập tính lên men , ảnh hƣởng của việc thay thế promoter của gen YHR087W bởi một trong những bản sao di truyền của nĩ cho promoter của gen PGK1.Theo các điều kiện stress thử nghiệm (Hình 3.2.5A), sự biểu hiện của gen này tăng từ 10 đến 40 lần trong trƣờng hợp của chủng ICV16 và 3-7 lần cho ICV27, mặc dù chỉ cĩ khả năng chống stress ethanol gia tăng trong cả hai chủng (với sự khác biệt ý nghĩa thống kê trong ICV16) với thao tác này (Hình 3.2.5B)[22].
Hình 3.2.5: Sự thay thế thích hợp promoter của HSP26 và YHR087W bằng PGK1 trên cả hai chủng ICV16 và ICV27 [22].
54
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ HƢỚNG PHÁT TRIỂN
4.1.Bàn luận
Trong tất cả các bƣớc sản xuất rƣợu vang, tế bào liên tục bị ảnh hƣởng bởi nhiều điều kiện stress nhƣ stress thẩm thấu, sự oxy hĩa, điều kiện pH thấp,thiếu chất dinh dƣỡng, và stress ethanol. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các tế bào nấm men cĩ thể đáp ứng với những điều kiện bất lợi thơng qua những thay đổi trong biểu hiện của nhiều gen trong suốt tồn bộ quá trình lên men (Marks et al.., 2008; Mendes-Ferreira et al., 2007; Rossignol et al, 2003;). Bên cạnh đĩ, một số điểm tƣơng quan giữa kháng stress, biểu hiện gen và phản ứng lên men đã cho thấy khả năng thích ứng với các điều kiện stress là một tiêu chí cho việc lựa chọn của nấm men rƣợu vang (Zuzuarregui và del Olmo, 2004a, b; Zuzuarregui et al., 2006)[19].
Sự biểu hện của gen chịu nhiều tác động của các yếu, các gen cĩ những chức năng riêng biệt và chịu trách nhiệm đảm nhận những qui luât quan trọng trong cơ chế đáp ứng các điều kiện stress của tế bào[18].
Sự hiểu biết tốt hơn về cơ chế phản ứng stress và một số kỹ thuật di truyền đã đƣợc thực hiện ở nấm men rƣợu vang với sức kháng đƣợc cải thiện đối với các điều kiện bất lợi xảy ra trong quá trình sản xuất rƣợu vang. Làm tăng tốc độ trong giai đoạn lên men tĩnh, nâng cao khả năng tồn tại trong điều kiện thiếu glucose[19].
Những biểu hiện của các nhân tố phiên mã Msn2p, tham gia vào phản ứng stress, cĩ thể đƣợc điều chỉnh để tạo sự cải tiến trong tính kháng stress và khả năng lên men (Cardona et al., 2007). Ảnh hƣởng của các thao tác di truyền với một tác động nhỏ trong phiên mã nấm men, tập trung vào hai gen stress đặc biệt: HSP26 và YHR087W. Sử dụng kết hợp bốn phƣơng thức khác nhau: sự biểu hiện trong espisomal plasmid hoặc centromeric plasmid dƣới sự đối chứng của promoter của chúng và thay thế của các promoter của các gen này ở bản sao di truyền của chúng cho promoter của gen SPI1 hoặc PGK1.
Những thác tác di truyền trên chủng ICV27 cĩ nhiều khĩ khăn, khơng thể duy trì đƣợc sự ổn định trong espisomal plasmid (khơng phải trên vector). Tuy nhiên, nĩ đã cĩ thể gắn và duy trì ổn định centromeric plasmid hoặc hiệu chỉnh trong bộ gen.
Các thao tác di truyền dẫn đến tăng biểu hiện của các gen. Bên cạnh đĩ, các chủng biến đổi trong một số trƣờng hợp cĩ nhiều khả năng chống lại các điều kiện bất lợi: stress thẩm thấu gây ra bởi nồng độ đƣờng cao và stress ethanol.
Một số chủng cĩ thể cải thiện khả năng lên men, và những tác động này phụ thuộc vào loại hèm tự nhiên đƣợc sử dụng, nhiệt độ tăng trƣởng và nồng độ đƣờng ban đầu. Vai trị quan trọng của gen YHR087W là cĩ khả năng chịu đƣợc nồng độ glucose cao và các điều kiện stress khác, và sự đột biến của nĩ cho thấy sự tăng trƣởng bị bất hoạt trong mơi trƣờng YPD chứa glucose 25%.
55
Sự điều tiết phản ứng stress trong nấm men rƣợu vang ảnh hƣởng đến khả năng lên men, nhƣng rất khĩ để dự đốn tác động cụ thể vào từng trƣờng hợp nên các nghiên cứu cần đƣợc thử nghiệm cẩn thận. Trong một số trƣờng hợp các thao tác di truyền thực hiện dƣờng nhƣ khơng mang lại kết quả ở điều kiện nồng độ đƣờng cao hoặc khơng kể sức kháng với điều kiện stress này và khả năng lên men cải thiện đƣợc nhận thấy. Các kết quả này cĩ thể đƣợc giải thích bởi thời điểm phản ứng đƣợc quyết định của cảm ứng trong các điều kiện stress; nhƣ dƣới điều kiện sốc nhiệt hoặc nồng độ glucose cao cảm ứng xảy ra rất nhanh chĩng và cấp độ sự biểu hiện ở cấp độ mRNA khoảng 2-6 lần giữa 30 phút và 2h sau khi tác động những điều kiện bất lợi (Gasch et al., 2000; Kaeberlein et al, 2002.), đây là thời gian đƣợc xem xét trong các thí nghiệm. Việc cải tiến đƣợc tìm thấy trong phƣơng pháp lên men rƣợu cĩ thể đƣợc giải thích bởi rất nhiều điều kiện stress diễn ra đồng thời hoặc theo một trình tự. Mặt khác, khi promoter YHR087W đƣợc thay thế bằng promoter của SPI1 và thí nghiệm trong mơi trƣờng chứa 25% glucose, khơng cĩ sự gia tăng cấp độ mRNA nào đƣợc tìm thấy trong bất kỳ chủng nào. Cuối cùng, trong các thao tác khác (ví dụ, trong biểu hiện của HSP26 ở espisomal plasmid trong chủng ICV16 hoặc trong centromeric plasmid trong chủng ICV27), các cấp độ mRNA tăng nhƣng khả năng tồn tại trong điều kiện stress đặc biệt là khơng đƣợc cải thiện, cho thấy rằng các thao tác của một gen cụ thể là khơng đủ để cĩ đƣợc một hiệu ứng tích cực trong tính năng này.
Điều thú vị, khi các promoter PGK1 đƣợc xem xét, sự biểu hiện của YHR087W tăng lên, nhƣng điều này đã khơng mang lại bất cứ cải tiến trong khả năng lên men, cĩ lẽ vì sự thiếu kiểm sốt thời gian chính xác trong biểu hiện trong suốt quá trình lên men. Theo đĩ, việc sử dụng điều hịa của một promoter mạnh với các biểu hiện thấp hơn ở những giai đoạn thuận lợi của quá trình, nhƣ PGK1, khơng thích hợp để thay đổi các cấp độ mRNA của gen stress với mục đích cải thiện khả năng lên men.
Mặc dù cĩ nhiều thí nghiệm đạt đƣợc một sự hiểu biết tốt hơn về cách cải thiện khả năng lên men trên cơ sở biểu hiện các thao tác trên gen kháng stress. Bên cạnh đĩ, cũng đã cung cấp một số hƣớng đi thú vị, trong đĩ cĩ sự liên quan của việc sử dụng các promoter SPI1 cho việc kiểm sốt sự biểu hiện của gen stress .