đại đoạn gen sau khi gắn promoter PGK1 vào vị trí SalI của plasmid pUG6. Các đầu 3’ của một nửa các oligonucleotide bắt cặp với trình tự của pUG6 nằm ở vị trí nucleotide thứ 10 ở đầu 5’ hay đầu 3’(tùy theo các oligonucleotide) của vị trí nối loxP[22].
3.2. Kết quả của thao tác gen tác động lên mức độ biểu hiện của gen HSP26 và YHR087W YHR087W
3.2.1.Minh chứng sự biểu hiện của HSP26 dƣới các điều kiện tác động nhiệt.
Những qui luật biểu hiện của protein dẫn đến phƣơng thức để chọn lọc một protein thiết lập rõ ràng điều kiện tăng trƣởng và pha tăng trƣởng để thu nhận tối đa lƣợng sinh khối.Trong những thí nghiệm trên chủng W303-1A, mang plasmid pL19, phát triển trong mơi trƣờng YNB tại 28oC và xác định OD ở 570nm, sau đĩ đƣợc tăng lên 39o
48
Hình.3.2.1: Hsp26 biểu hiện trong các chủng khác nhau trƣớc và sau khi sốc nhiệt. (A) nhuộm Coomassie blue- SDS-PAGE của protein tổng số biểu hiện từ các chủng nấm men trong quá trình tăng trƣởng và sau khi nhiệt sốc. cột, L13 (hsp26) chủng phát triển ở 28°C; cột 2, L13 gia nhiệt đến 39°C trong 90 phút; ngõ 3, Oli H1 (HSP26) chủng phát triển ở 28°C; cột 4, Oli H1 gia nhiệt đến 39°C trong 90 phút; cột 5, W303-1A cĩ chứa một chủng bản sao nhiễm sắc thể của gen HSP26 và mang theo một plasmid bản sao pL19 với đoạn mã hĩa HSP26 phát triển ở 28°C; cột 6, W303-1A gia nhiệt lên 39°C trong 90 phút; P, đại diện cho trọng lƣợng marker phân tử: galactosidase (116 kDa), phosphorylase B (97,4 kDa), albumin từ huyết thanh trâu bị (66 kDa); ovoalbumin (45 kDa) và carbonic anhydrase(29 kDa). (B) phân tích Western-Blot sử dụng một kháng thể bắt nguồn từ tế bào khác chuyên biệt chống lại tác động của Hsp26 [17].
49
Dƣới các điều kiện kiểm sốt, chủng L13, mang đoạn thiếu hụt trên bản sao nhiễm sắc thể của HSP26 và OliH1, chứa một nhiễm sắc thể của HSP26, và đƣợc biểu hiện trên mơi trƣờng YNB. Một so sánh trên SDS-PAGE đã cung cấp tồn bộ protein của thành tế bào bao gồm các tế bào trƣớc và sau khi tác động nhiệt( Hình 3.2.1A). Chủng W303-1A mang nhiều bản sao của plasmid đã thể hiện một protein lớn của khối lƣợng phân tử 26kDa khơng phụ thuộc vào pha phát triển ( Hình 3.2.1A cột 5 ,6). Dải polypeptide khơng đƣợc biểu hiện trên L13( hinh 1A,cột 1 và 2) cũng nhƣ là chủng Oli H1 ( hinh 3.2.1A, cột 3 và 4). Điều này chứng tỏ rằng mức độ biểu hiện của hsp26 dựa trên sự tác động của nhiệt độ.
Để xác định mức độ biểu hiện của protein đoạn polypeptide, sau khi điện di protein đƣợc chuyển sang màng lọc nitrocellulose và biểu hiện bởi một kháng thể HSP26 chuyên biệt. Ngồi ra phân tích Western Blot cũng chỉ ra rằng HSP26 khơng đƣợc biểu hiện trên chủng L13 trƣớc và sau khi shock nhiệt. Cũng nhƣ là các tế bào của Oli H1(Hình. 3.2.1B, cột 3),nhƣng nĩ bị tác động tác động nhiệt (hình. 3.2.1B, cột 4),và nĩ đƣợc biểu hiện bởi các tế bào chứa các bản sao của plasmid (Hình. 3.2.1B, cột 5và 6). Những kết quả rõ ràng sự biểu hiện của protein nhƣ HSP26 và chỉ ra rằng sự gắn Hsp26 trong những bản sao của plasmid hƣớng đến sự điều chỉnh phiên mã của gen này [17].