Hiện nay người ta dùng phương pháp PCR để xác định các gen độc tố của E. coli, đây là phương pháp ưu việt nhất về độ nhạy và tính chính xác của nó.
- Cách tiến hành:
+ ADN mẫu: khuẩn lạc E. coli mọc trên môi trường thạch máu ở 370C/24h.
+ Hỗn hợp phản ứng PCR:
Primers: 1 µl mỗi loại Dung dịch đệm (5 X): 5,0 µl
Enzym (Taq polymerase): 0,5 µl
Nước khử ion vừa đủ để đạt được thể tích cuối cùng là 25µl cho 1 phản ứng.
+ Chu trình của một phản ứng PCR (Amplification): phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và được thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer, theo bảng 1.
+ Chạy điện di: sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye), được trộn vào mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1%, trong dung dịch đệm TAE (Tris - agartate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút.
+ Nhuộm: gel thạch sau khi chạy điện di được nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium bromide (1µl/ml) trong vòng 15 phút đọc kết quả.
Bảng 1: Chu trình của phản ứng PCR Thành phần Chu trình
thứ nhất 30 chu trình tiếp theo
Chu trình cuối Biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) ADN khuôn, primer, Taq polymerase, dNTP 94/5 94/0,5 55/0,5 72/0,5 72/7 - Đọc kết quả:
Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Polaroid camera. Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại. Kích thước các băng ADN được so sánh với ADN chuẩn (ADN marker).