Sau khi tiến hành chạy mẫu bằng chế độ chạy tự động trên máy ta thu đ−ợc sắc ký đồ đ−ợc trình bày ở hình 3.1:
Hình 3.1. Sắc ký đồ thành phần axit amin trong sữa ong chúa
Qua sắc ký đồ ta thấy axít aspartic có chiều cao pic là cao nhất đồng nghĩa với diện tích pic của nó lớn nhất nên hàm l−ợng của axít này trong sữa ong chúa so với các axít amin khác là cao nhất. Tiếp theo axít aspartic là axít glutamic, tiếp đến là các pic của các axit min có chiều cao pic hơn kém nhau không nhiều là valin, leucin, lysin, phenylalanin… và pic thấp nhất là histidin. Qua việc sử dụng các phần mềm trên máy tính ta thu đ−ợc bảng giá trị hàm l−ợng các axít amin có trong sữa ong chúa nh− bảng 3.1.
Bảng 3.1: Hàm lượng các axít amin trong sữa ong chúa
( g axít amin/ 100g mẫu)
Từ bảng trên, ta xây dựng đ−ợc biểu đồ sau:
Stt Axít amin % Stt Axít amin %
1 Axít Aspartic 5.54 10 Cystein + cystin 0.45
2 Axít Glutamic 3.39 11 Valin 2.14
3 Serin 1.25 12 Methionin 0.60 4 Histidin 0.21 13 Phenylalanin 1.73 5 Glycin 1.30 14 Isoleucin 1.64 6 Threonin 1.54 15 Leucin 2.74 7 Alanin 1.15 16 Lysin 2.90 8 Arginin 1.64 17 Proline 0.97 9 Tyrosin 1.20 Tổng số 30.39
Axit Aspartic Axit Glutamic Serine Histidine Glycine Threonine Alanine Arginine Tyrosine Cysteine + cystine Valine Methionine Phenylalanine Isoleucine Leucine Lysine Proline other
Hình 3.2: Biểu đồ biểu thị hàm l−ợng axít amin trong sữa ong chúa
Axít amin chính là sản phẩm phân giải của protein, là đơn vị cơ bản tạo nên protein. Mục tiêu cuối cùng của quá trình con ng−ời hấp thụ protein là có đ−ợc các axít amin cần thiết cho cơ thể. Dựa vào bảng 3.1 và biểu đồ biểu thị hàm l−ợng axít amin trong sữa ong chúa ta thấy tổng số axít amin có trong sữa ong chúa t−ơng đối cao, chiếm khoảng 30,39 %. Trong số đó có chứa những axít amin thiết yếu đối với cơ thể con ng−ời nh−: valin (2.14%), leucin (2.74%), methionine (0.6%), threonin (1,54 %), phenylalanin (1.73%), lysin (2.90%), arginin (1.64%). Tất cả các axit amin này đều có hàm l−ợng t−ơng đối cao. Nh− vậy, với việc xác định đ−ợc hàm l−ợng các axít amin nói chung và các axít amin thiết yếu nói riêng thì ta thấy rằng sữa ong chúa cũng là một nguồn cung cấp các axít amin quan trọng cho cơ thể ng−ời.
3.1.3. Kết quả xác định cấu trúc hợp chất 1 (10-HDA)
Hợp chất 1: axít 10 – Hydroxy - 2- decenoic (10- HDA) đ−ợc phân tách từ dịch chiết CH2Cl2: MeOH d−ới dạng bột vô định hình màu trắng.
Trên phổ 1H - NMR cho thấy các tín hiệu rất đặc tr−ng của một axít béo có một nối đôi tại δ 5.81 ( dt, 1.5 Hz; 17Hz) và δ 6,97 (dt, 7Hz; 17Hz) là của H-2 và H-3 dạng trans. Ngoài ra tín hiệu triplet tại δ 3.56 (t, 6,5 Hz) là của proton H-10. Hai proton H-4 có tín hiệu cộng h−ởng tại δ 2,25 trong khi H-9 có tín hiệu cộng h−ởng tại δ 2,30. Bốn cặp proton H-5, H-6, H-7 và H-8 có các tín hiệu trùng lặp tại δ 1,55 ppm và δ 1,50 ppm .Phổ 1H –NMR của chất 1 đ−ợc mô tả ở hình 3.3 d−ới đây.
Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của chất 1 (10-HDA)
Ngoài ra, dựa vào phổ khối bụi electron (ESI-MS) cho píc ion phân tử giả định [M+H]+ tại m/z 186.8 ứng với công thức phân tử C10H18O3.
Hình 3.4: Phổ ESI-MS của chất 1 (10-HDA)
Dựa vào phổ khối l−ợng phân tử và các tín hiệu trên phổ cộng h−ởng từ hạt nhân 1H-NMR, kết hợp với các tài liệu về phổ, hợp chất 1 đ−ợc xác định là axit 10-Hydroxy - 2- decenoic (10- HDA) phù hợp với các số liệu của tác giả Naoki Noda và cộng sự đã công bố vào năm 2005 [46]. D−ới đây là công thức của hợp chất 1.
Hình 3.5: Cấu trúc hợp chất 1 (axit 10-Hydroxy - 2- decenoic)
D−ới đây là bảng số liệu phổ 1H - NMR của chất 1 so với các dữ liệu của Naoki Noda [46].
Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H –NMR của chất 1
C Số nguyên tử H δHa,c
, ppm (J, Hz)
theo tài liệu [28,46]
δHa,c , ppm (J, Hz) 1 - 2 1H 5,87(dt, 1.5Hz;15,6Hz) 5,81(dt,1,5Hz, 17Hz) 3 1H 6.94 (dt, 7.1Hz; 15.6 Hz) 6,97 (dt, 7Hz; 17Hz) 4 2H 2.22(ddt, 1.5Hz; 7.1 Hz; 7.6 Hz) 2,25 (m) 5 2H 1,48(m) 1,55 (m) 6 6H 1,35(m) 1,55 (m) 7 1,35 (m) 1,50 (m) 8 1,35(m) 1,50 (m) 9 2H 2,22 (m) 2,25(m) 10 2H 3,53(t, 6.6 Hz) 3.56 (t, 6,5 Hz)
10 - HDA là một axít béo có nhiều hoạt động d−ợc lý quan trọng đã đ−ợc công bố nh− có khả năng chống ung th−, làm tăng khả năng miễn dịch, kích thích sự sinh tr−ởng và phát triển của cơ thể... Do vậy việc phân lập và xác định đ−ợc cấu trúc của 10 - HDA là có ý nghĩa chứng minh trong sữa ong chúa có chứa thành phần quan trọng này. So với các tài liệu khác, 10-HDA đ−ợc phân lập từ sữa ong chúa đều sử dụng máy HPLC. Còn với nghiên cứu này chỉ cần dùng các ph−ơng pháp chạy cột sắc ký thông th−ờng đã phân lập
đ−ợc 10-HDA từ sữa ong chúa. Điều đó sẽ giúp chúng ta giảm rất nhiều chi phí khi phân lập hợp chất này.
3.1.4. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào
Kết quả thử hoạt tính gây độc lên tế bào ung th− biểu mô của dịch chiết sữa ong chúa đ−ợc trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Kết quả thử độc tính với tế bào ung th− biểu mô của sữa ong chúa
STT Ký hiệu mẫu IC50 ( àg/ml) 1 Sữa ong chúa > 256
2 Elipticin 0,31- 0,62
Elipticin là chất đã đ−ợc thế giới công nhận có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung th− biểu mô với giá trị IC50 ở nồng độ khoảng 0,5 àg/ml. còn sữa ong chúa chỉ có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung th− biểu mô ở nồng độ 256 àg/ml trở lên. Điều này có thể giải thích là do hàm l−ợng 10-HDA chiếm khoảng 1-2% trong sữa ong chúa, do đó các phân đoạn 10- HDA sau đó đ−ợc phân tích và làm giàu từ mẫu sữa ong chúa sẽ có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung th− biểu mô ở nồng độ thấp hơn hàng trăm lần; hoặc dòng tế bào này ch−a phải là đích của các hoạt chất trong sữa ong chúa. Vì vậy sữa ong chúa chỉ có tác dụng phòng hoặc hỗ trợ điều trị với dòng ung th− biểu mô.
Tuy nhiên, các nghiên cứu tiếp theo trên các dòng tế bào ung th− máu, ung th− gan... có thể phải dựng với nồng độ cao hơn hoặc thử với các dịch chiết thành phần.
3.2. Kết quả nghiên cứu từ phấn hoa 3.2.1. Phân lập các dịch chiết 3.2.1. Phân lập các dịch chiết
Sau khi chiết mẫu phấn hoa có khối l−ợng là 450 gam trong các dung môi có độ phân cực tăng dần ta thu đ−ợc kết quả nh− sau:
- Dịch chiết phấn hoa trong n-hexan với khối l−ợng là 5,6 gam. - Dịch chiết phấn hoa trong etylaxetat với khối l−ợng là 2,1388 gam. - Dịch chiết phấn hoa trong metanol với khối l−ợng là 152,16 gam.
3.2.2. Kết quả xác định cấu trúc hợp chất 2 (7-O- β – Xyloside-naringenin) naringenin)
Hợp chất 2 (7-O- β - Xyloside-naringenin) đ−ợc phân lập từ dịch chiết phấn hoa trong metanol d−ới dạng tinh thể màu trắng.
D−ới đây là sắc ký đồ HPLC và phổ UV của hợp chất 2.
Hình 3.7: Phổ UV – pic 1
Hình 3.8: Phổ UV – Pic 2
Trên phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu rất đặc tr−ng của hệ vòng thơm AA’BB’ của vòng B đ−ợc quan sát tại δ 7,30 (d; 8,8 Hz) và 6,80 (d; 8,8 Hz) là t−ơng ứng của hai cặp proton H-2’/H-6’ và H-3’/H-5’. Hai proton t−ơng tác
meta – của vòng A cộng h−ởng tại δ 6,34 (d; 2,2 Hz); 6,11 (d; 2,2 Hz) là thuộc về H -6 và H-8. Proton H-2 có tín hiệu cộng h−ởng tại δ 5,33 d−ới dạng douplet có hằng số t−ơng tác spin 5Hz và 10Hz. Hai proton H-3A và H-3B đ−ợc quan sát tại δ 2,07 và δ 3,01 có hằng số t−ơng tác spin 15Hz và 20 Hz. Trên phổ 1H-NMR cũng cho thấy sự có mặt của phần đ−ờng do xuất hiện tín hiệu cộng h−ởng của proton anomeric tại δ 4,88 (1H; d; 5,0 Hz) bị khuất bởi pic n−ớc và các proton của phần đ−ờng cộng h−ởng tại δ 3,61; δ 3,56 và δ
3,42. Phổ 1H- NMR của hợp chất 2 đ−ợc trình bày ở hình 3.9. P e a k # 21 0 0 % , 0 , 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 5 9 5 % n m 2 2 6 . 3 2 0 2 . 4 2 8 2 . 4 N o s p e c t r a lib r a r y h it s f o u n d ! P e a k # 11 0 0 % , 0 , 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 5 9 5 % n m 2 2 6 . 1 2 8 2 . 3 5 6 3 . 6 N o s p e c t r a lib r a r y h it s f o u n d !
Hình 3.9: Phổ 1H-NMR của chất 2
Trên phổ khối bụi điện tử (positive mode) cho ion pic giả định phân tử tại m/z 404,8 [M+H]+, (negative mode) tại m/z 403.0 [M-H]-, tại m/z 427 [M+Na]+, chỉ ra khối l−ợng phân tử của hợp chất 2 là 404 ứng với công thức C20H20O9. Phổ khối bụi điện tử của chất 2 đ−ợc thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10: Phổ ESI – MS của chất 2
Dựa vào phổ khối l−ợng phân tử và các tín hiệu cộng h−ởng từ hạt nhân, kết hợp với các tài liệu về phổ, hợp chất 2 đ−ợc xác định là 7-O- β - Xyloside-naringenin. Công thức cuủa chất 2 đ−ợc xác định nh− sau:
Hình 3.11: Cấu trúc của chất 2 (7-O- β – Xyloside-naringenin)
D−ới đây là bảng số liệu các dữ kiện phổ 1H - NMR của chất 2 so với các tài liệu.
Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H –NMR của chất 2 Vị trí δH(ppm), J (Hz) *δH(ppm),J Hz) [49,57] Aglycon 2 5,33 (dd; 5;10) 5,98 (dd; 5,25, 12) 3A 3B 2,70 (dd; 5; 15) 3,01 (dd; 15; 20) 2,80 (d; 17) (eq) 3,31 (q; 2,0) (ax) 4 5 6 6,34 (d; 2,2) 6,42(d; 2,5) 7 8 6,11(d; 2,2) 6,84(d; 2,5) 9 10 1´ 2´ 7,30(d; 8,8) 7,85(d; 8,5) 3´ 6,80(d; 8,8) 6,94(d;8.5) 4´ 5´ 6,80(d; 8,8) 6,94(d;8,5) 6´ 7,30(d; 8,8) 7,85(d;8,5) Xylose 1´´ 4,88 (d; 5,0) 4,85 (d;7,8)) 2´´ 3,44 (dd; 5,0; 15) 3,40 (m) 3´´ 3,30 (dd) 3,29 (ddd; 8,7; 8,7; 4,2)
4´´ 3,42 (dd) 3,42 (m) 5´´ 4,0 (dd; 5,0; 10) 3,81 (dd; 4,0; 10,8)
Hợp chất 2 xác định đ−ợc là một glycozit flavonoit, theo nhiều công bố lớp chất này có hoạt tính chống oxi hoá mạnh, nên việc phân lập và xác định cấu trúc của hợp chất 2 là rất có ý nghĩa. Điều này khẳng định thêm rằng trong phấn hoa chứa flavonoit là những tác nhân có hoạt tính chống oxi hoá.
Flavonoit là một lớp chất khá phổ biến xuất hiện trong thực vật d−ới dạng tự do hoặc glycozit. Chúng là những sản phẩm đ−ợc thiết lập từ một đơn vị gốc cinnamoyl-CoA, với sự kéo dãn mạch dùng ba phân tử malonyl-CoA.
Flavonoit góp phần cấu thành màu sắc của thực vật và hấp thụ mạnh tia UV. Tuy nhiên một số flavon không màu nh−ng vẫn hấp thụ rất mạnh các tia UV.
OH CoAS O + 3 Malonyl-CoA -3 CO2 -3 CoASH OH O O O O SCoA OH O O O O - CoASH OH O OH OH HO Chalcone OH O OH O HO Naringenin (Flavanone) OH O OH O HO OH Dihydrokaempferol (Flavanonol or Dihydroflavonol) OH OH OH O HO OH Leukopelargonidin (Flavan-3,4-diol) OH O OH O HO OH Kaempferol (Flavonol) OH O OH O HO Apigenin (Flavon) Red. Oxi. Oxi. Enzymmatic Chalcone-Flavone- isomerase Spontan
Hình 3.12: Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp các Flavonoit
Ngoài ra, 7 - O - β - Xyloside - naringenin có thể đ−ợc sinh tổng hợp theo sơ đồ sau nhờ sự có mặt của E .coli [18].
Hình 3.13: Sơ đồ sinh tổng hợp của 7 – O - β– Xyloside – naringenin [18] 3.2.3. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá
Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá (peroxydaza) đ−ợc trình bày ở bảng 3.5 nh− sau:
Bảng 3.5: Kết quả thử hoạt tính chống oxi hoá của phấn hoa
STT Mẫu IC50 (àg/ml) 1 Dịch chiết phấn hoa trong etylaxetat 65,88
2 Dịch chiết phấn hoa trong metanol 46,0
3 Dịch chiết phấn hoa trong n-hexan 104,8
4 Resveratrol 5,24
Kết quả ở bảng 3.5 đ−ợc biểu diễn ở hình 3.19.
0 20 40 60 80 100 120
P_H(etylaxetat) P_H (metanol) P_H (n-hexan) Resveratrol
Hình 3.14: Biểu đồ hoạt tính của phấn hoa
Theo bảng 3.5 và hình 3.14 cho thấy resveratrol là một chất có khả năng chống oxi hoá tốt đã đ−ợc thế giới công nhận và đ−ợc sử dụng nh− là đối chứng d−ơng có giá trị IC50 ở nồng độ 5,24 àg/ml. Trong ba dịch chiết của phấn hoa thì dịch chiết phấn hoa trong metanol là có khả năng chống oxi hoá cao nhất với giá trị IC50 ở nồng độ 46,0 àg/ml, tiếp đó là dịch chiết phấn hoa trong etylaxetat có giá trị IC50 ở nồng độ 65,88 àg/ml. Còn dịch chiết phấn
hoa trong n-hexan với giá trị IC50 ở nồng độ 104,8 àg/ml có hoạt tính chống oxi hoá kém nhất. Điều này đ−ợc giải thích là trong phấn hoa chứa các flavonoit. Flavononit là những chất có độ phân cực trung bình nên tan đ−ợc trong các dung môi phân cực vừa và t−ơng đối phân cực. Chính vì thế mà l−ợng flavonoit có trong phấn hoa tập trung ở dịch chiết metanol và l−ợng ít hơn ở trong dịch chiết etylaxetat, và hầu nh− không có ở dịch chiết n-hexan. Khả năng chống oxi hoá có thể mạnh hơn nếu hàm l−ợng flavonoit cao hơn. Do đó các phân đoạn chứa nhiều flavonoit sẽ có khả năng chống oxi hoá tốt hơn. Nh− vậy, phấn hoa có khả năng chống oxi hoá khá tốt. Con ng−ời có thể sử dụng phấn hoa cho mục đích chống oxi hoá nh− một thực phẩm chức năng.
Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài “nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của sữa ong chúa và phấn hoa” đã thu đ−ợc các kết quả nh− sau:
1. Xác định đ−ợc hàm l−ợng protein có trong sữa ong chúa là 13,1% t−ơng đối cao so với các thành phẩm khác thu đ−ợc từ ong.
2. Xác định đ−ợc 17 axít amin có mặt trong sữa ong chúa bao gồm nhiều axít amin thiết yếu.
3. Phân lập và xác định cấu trúc đ−ợc 2 hợp chất, trong đó chất 1 đ−ợc phân lập từ sữa ong chúa là 10-HDA (axít 10 - Hydroxy - 2- decenoic) và hợp chất 2 đ−ợc phân lập từ phấn hoa là 7 - O - β- Xyloside - naringenin.
4. Đã thử đ−ợc hoạt tính độc tế bào với sữa ong chúa cho kết quả sữa ong chúa có khả năng ức chế các tế bào ung th−.
5. Đã thử hoạt tính chống oxi hoá của phấn hoa cho kết quả là phấn hoa có hoạt tính chống oxi hoá tốt, và có hoạt tính tốt nhất là dịch chiết của phấn hoa trong metanol.
Kiến Nghị
1. Tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất khác có hoạt tính có trong sữa ong chúa và phấn hoa.
2. Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn các hoạt tính sinh học nh− hoạt tính gây độc lên các dòng tế bào khác, hoạt tính chống oxi hoá, thử các hoạt tính trên chuột, vi sinh vật... của sữa ong chúa, phấn hoa, các dịch chiết từ hai đối t−ợng trên.
Tài liệu tham khảo
tiếng việt
1. Nguyễn Bá, (2007), “Hình thái học thực vật”, Nhà xuất bản Giáo dục.
2. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Ch−ơng, Nguyễn Th−ợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn, (2004), Cây
thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ
thuật Hà Nội, tập I, trang 827-828.
3. Nguyễn Hữu Đính, Đỗ Đình Rãng, (2003), “Hoá học hữu cơ 1”, Nhà xuất bản Giáo dục.
4. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị áng, (2009), Hoá Sinh học, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
tiếng anh
5. Agrawal P.K., (1989), “Carbon - 13 NMR of flavonoids”, Elsevier Science Pub.B.V,.
6. Anna Gloria Sabatini, Gian Luigi Marcazzan1, Maria Fiorenza Caboni, Stefan Bogdanov, Ligia Bicudo de Almeida-Muradian, (2009), “Quality and standardisation of Royal Jelly”, Journal of ApiProduct and
ApiMedical Science 1(1): 16-21.
7. Antinelli, J. F., Zeggane.S., Davico.R., Rognone.C., Faucon.J P., Lizzani.L., (2003), “Evaluation of (E)-10-hydroxydec-2- enoic acid as a freshness parameter for royal jelly”. Food Chemistry 80: 85-89.
8. Aziza A. El-Nekeety, Wafaa El-Kholy, Naglaa F. Abbas, Ahmad Ebaid, Hassan A. Amraa, Mosaad A. Abdel-Wahhaba, (2007), “Efficacy of
royal jelly against the oxidative stress of fumonisin in rats”, Toxicon 50, p. 256–269.
9.Barth, O.M, Luz, C.F.P., (1998). “Melissopalynological data obtained from a mangrove area near to Rio de Janeiro”, Brazil. Journal of Apicultural
Research 37 (2), 155–163.
10. Benfenati, L; Sabatini, A G; Nanetti, A (1986) “Composizione in sali minerali della gelatina reale”, Apicoltura 2: 129-143.
11. Boselli. E., Caboni. M F., Sabatini. A G., Marcazzan. G L., Lercker. G., (2003), “Determination and changes of free amino acids in royal jelly