* Chọn dung môi chiết
Th−ờng thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong thực vật có độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong n−ớc ít khi đ−ợc quan tâm. Dung môi dùng cho quá trình chiết cần phải đ−ợc lựa chọn rất cẩn thận. Điều kiện của dung môi là phải hoà tan đ−ợc những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng đ−ợc loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy. Những dung môi này nên đ−ợc ch−ng cất để thu đ−ợc dạng sạch tr−ớc khi sử dụng.
Sau khi chiết dung môi đ−ợc cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 400- 450C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
* Quá trình chiết
Quá trình chiết đơn giản đ−ợc phân loại nh− sau: - Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết sắc với dung môi n−ớc. - Chiết lôi cuốn theo hơi n−ớc. - Chiết siêu âm.
Tuỳ thuộc mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện qui trình chiết hợp lí để đạt hiệu quả cao.
b. Các ph−ơng pháp sắc ký * Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng đ−ợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC – Alufolien 60 F254 (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai b−ớc sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử, sấy khô hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.
Cách đ−a chất lên TLC: Lấy một l−ợng nhỏ mẫu chất hoà tan bằng 2-3 giọt dung môi thích hợp, sau đó dùng capila chấm chất lên lớp mỏng.
Dung môi: Pha hệ dung môi thích hợp, lắc kỹ cho các dung môi trộn đều nhau trong hệ rồi cho vào bình khai triển đáy bằng có nắp nhám. Đậy nắp lại và đợi đến khi dung môi bão hoà thì cho bản mỏng vào chạy.
* Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột đ−ợc tiến hành với hợp chất hấp phụ là silica Gel có cỡ hạt là 0,04 -0,063 mm.
Dung môi đ−ợc dùng trong sắc ký cột là: metanol, diclometan, n-hexan, etylaxetat, axeton… Các dung môi đều đ−ợc làm khan, ch−ng cất lại và bảo quản trong chai kín.
Chất cần phân tách bằng sắc ký cột đ−ợc hoà tan trong dung môi, thêm một l−ợng nhỏ chất hấp phụ. Trộn đều hỗn hợp và làm bay hơi hết dung môi. thu đ−ợc hỗn hợp ở dạng bột tơi. Khi đ−a chất lên cột chất hấp phụ phải dàn đều và dùng bông thuỷ tinh phủ lên bề mặt chất.
Nhồi cột sắc ký theo ph−ơng pháp nhồi khô hoặc nhồi −ớt, trong quá trình nhồi cột phải loại bỏ triệt để các bọt khí bằng cách cho dung môi chảy qua cột nhiều lần và gõ nhẹ vào thân cột. Khi cột đã ổn định có thể tiến hành chạy sắc ký cột.
* Sắc ký lỏng hiệu năng cao – phân tích (HPLC – phân tích)
Đối với kỹ thuật HPLC phân tích, hiệu năng phân tách đạt đ−ợc dựa trên việc sử dụng bơm áp suất cao để đẩy dung môi pha động qua cột sắc ký. Kỹ thuật phân tích HPLC đ−ợc sử dụng để nhận dạng các pic từ các dịch chiết hoặc các phân đoạn. Các thành phần khác nhau đ−ợc đ−a qua cột với các tốc độ dòng tuỳ theo sự phân bố giữa dung môi pha động và pha tĩnh. Hệ dung môi đ−ợc dùng d−ới dạng gradient là MeOH : n−ớc (nanopure) có sử dụng đệm pH=2 bằng axít photsphoric với sự tăng dần của MeOH đến 100% trong
thời gian 45 phút. Các hợp chất đ−ợc phát hiện bằng UV- VIS diode array detector.
* Sắc ký lỏng hiệu năng cao - điều chế (HPLC – preparative)
Ph−ơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế là ph−ơng pháp hiện đại nhất để phân lập các hợp chất có độ phân cực cao đối với các phân đoạn đã qua xử lý bằng các cột sắc ký thích hợp. Các hợp chất đ−ợc phát hiện trên UV – VIS diode array detector.