naringenin)
Hợp chất 2 (7-O- β - Xyloside-naringenin) đ−ợc phân lập từ dịch chiết phấn hoa trong metanol d−ới dạng tinh thể màu trắng.
D−ới đây là sắc ký đồ HPLC và phổ UV của hợp chất 2.
Hình 3.7: Phổ UV – pic 1
Hình 3.8: Phổ UV – Pic 2
Trên phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu rất đặc tr−ng của hệ vòng thơm AA’BB’ của vòng B đ−ợc quan sát tại δ 7,30 (d; 8,8 Hz) và 6,80 (d; 8,8 Hz) là t−ơng ứng của hai cặp proton H-2’/H-6’ và H-3’/H-5’. Hai proton t−ơng tác
meta – của vòng A cộng h−ởng tại δ 6,34 (d; 2,2 Hz); 6,11 (d; 2,2 Hz) là thuộc về H -6 và H-8. Proton H-2 có tín hiệu cộng h−ởng tại δ 5,33 d−ới dạng douplet có hằng số t−ơng tác spin 5Hz và 10Hz. Hai proton H-3A và H-3B đ−ợc quan sát tại δ 2,07 và δ 3,01 có hằng số t−ơng tác spin 15Hz và 20 Hz. Trên phổ 1H-NMR cũng cho thấy sự có mặt của phần đ−ờng do xuất hiện tín hiệu cộng h−ởng của proton anomeric tại δ 4,88 (1H; d; 5,0 Hz) bị khuất bởi pic n−ớc và các proton của phần đ−ờng cộng h−ởng tại δ 3,61; δ 3,56 và δ
3,42. Phổ 1H- NMR của hợp chất 2 đ−ợc trình bày ở hình 3.9. P e a k # 21 0 0 % , 0 , 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 5 9 5 % n m 2 2 6 . 3 2 0 2 . 4 2 8 2 . 4 N o s p e c t r a lib r a r y h it s f o u n d ! P e a k # 11 0 0 % , 0 , 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 5 9 5 % n m 2 2 6 . 1 2 8 2 . 3 5 6 3 . 6 N o s p e c t r a lib r a r y h it s f o u n d !
Hình 3.9: Phổ 1H-NMR của chất 2
Trên phổ khối bụi điện tử (positive mode) cho ion pic giả định phân tử tại m/z 404,8 [M+H]+, (negative mode) tại m/z 403.0 [M-H]-, tại m/z 427 [M+Na]+, chỉ ra khối l−ợng phân tử của hợp chất 2 là 404 ứng với công thức C20H20O9. Phổ khối bụi điện tử của chất 2 đ−ợc thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10: Phổ ESI – MS của chất 2
Dựa vào phổ khối l−ợng phân tử và các tín hiệu cộng h−ởng từ hạt nhân, kết hợp với các tài liệu về phổ, hợp chất 2 đ−ợc xác định là 7-O- β - Xyloside-naringenin. Công thức cuủa chất 2 đ−ợc xác định nh− sau:
Hình 3.11: Cấu trúc của chất 2 (7-O- β – Xyloside-naringenin)
D−ới đây là bảng số liệu các dữ kiện phổ 1H - NMR của chất 2 so với các tài liệu.
Bảng 3.4: Số liệu phổ 1H –NMR của chất 2 Vị trí δH(ppm), J (Hz) *δH(ppm),J Hz) [49,57] Aglycon 2 5,33 (dd; 5;10) 5,98 (dd; 5,25, 12) 3A 3B 2,70 (dd; 5; 15) 3,01 (dd; 15; 20) 2,80 (d; 17) (eq) 3,31 (q; 2,0) (ax) 4 5 6 6,34 (d; 2,2) 6,42(d; 2,5) 7 8 6,11(d; 2,2) 6,84(d; 2,5) 9 10 1´ 2´ 7,30(d; 8,8) 7,85(d; 8,5) 3´ 6,80(d; 8,8) 6,94(d;8.5) 4´ 5´ 6,80(d; 8,8) 6,94(d;8,5) 6´ 7,30(d; 8,8) 7,85(d;8,5) Xylose 1´´ 4,88 (d; 5,0) 4,85 (d;7,8)) 2´´ 3,44 (dd; 5,0; 15) 3,40 (m) 3´´ 3,30 (dd) 3,29 (ddd; 8,7; 8,7; 4,2)
4´´ 3,42 (dd) 3,42 (m) 5´´ 4,0 (dd; 5,0; 10) 3,81 (dd; 4,0; 10,8)
Hợp chất 2 xác định đ−ợc là một glycozit flavonoit, theo nhiều công bố lớp chất này có hoạt tính chống oxi hoá mạnh, nên việc phân lập và xác định cấu trúc của hợp chất 2 là rất có ý nghĩa. Điều này khẳng định thêm rằng trong phấn hoa chứa flavonoit là những tác nhân có hoạt tính chống oxi hoá.
Flavonoit là một lớp chất khá phổ biến xuất hiện trong thực vật d−ới dạng tự do hoặc glycozit. Chúng là những sản phẩm đ−ợc thiết lập từ một đơn vị gốc cinnamoyl-CoA, với sự kéo dãn mạch dùng ba phân tử malonyl-CoA.
Flavonoit góp phần cấu thành màu sắc của thực vật và hấp thụ mạnh tia UV. Tuy nhiên một số flavon không màu nh−ng vẫn hấp thụ rất mạnh các tia UV.
OH CoAS O + 3 Malonyl-CoA -3 CO2 -3 CoASH OH O O O O SCoA OH O O O O - CoASH OH O OH OH HO Chalcone OH O OH O HO Naringenin (Flavanone) OH O OH O HO OH Dihydrokaempferol (Flavanonol or Dihydroflavonol) OH OH OH O HO OH Leukopelargonidin (Flavan-3,4-diol) OH O OH O HO OH Kaempferol (Flavonol) OH O OH O HO Apigenin (Flavon) Red. Oxi. Oxi. Enzymmatic Chalcone-Flavone- isomerase Spontan
Hình 3.12: Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp các Flavonoit
Ngoài ra, 7 - O - β - Xyloside - naringenin có thể đ−ợc sinh tổng hợp theo sơ đồ sau nhờ sự có mặt của E .coli [18].
Hình 3.13: Sơ đồ sinh tổng hợp của 7 – O - β– Xyloside – naringenin [18] 3.2.3. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá
Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá (peroxydaza) đ−ợc trình bày ở bảng 3.5 nh− sau:
Bảng 3.5: Kết quả thử hoạt tính chống oxi hoá của phấn hoa
STT Mẫu IC50 (àg/ml) 1 Dịch chiết phấn hoa trong etylaxetat 65,88
2 Dịch chiết phấn hoa trong metanol 46,0
3 Dịch chiết phấn hoa trong n-hexan 104,8
4 Resveratrol 5,24
Kết quả ở bảng 3.5 đ−ợc biểu diễn ở hình 3.19.
0 20 40 60 80 100 120
P_H(etylaxetat) P_H (metanol) P_H (n-hexan) Resveratrol
Hình 3.14: Biểu đồ hoạt tính của phấn hoa
Theo bảng 3.5 và hình 3.14 cho thấy resveratrol là một chất có khả năng chống oxi hoá tốt đã đ−ợc thế giới công nhận và đ−ợc sử dụng nh− là đối chứng d−ơng có giá trị IC50 ở nồng độ 5,24 àg/ml. Trong ba dịch chiết của phấn hoa thì dịch chiết phấn hoa trong metanol là có khả năng chống oxi hoá cao nhất với giá trị IC50 ở nồng độ 46,0 àg/ml, tiếp đó là dịch chiết phấn hoa trong etylaxetat có giá trị IC50 ở nồng độ 65,88 àg/ml. Còn dịch chiết phấn
hoa trong n-hexan với giá trị IC50 ở nồng độ 104,8 àg/ml có hoạt tính chống oxi hoá kém nhất. Điều này đ−ợc giải thích là trong phấn hoa chứa các flavonoit. Flavononit là những chất có độ phân cực trung bình nên tan đ−ợc trong các dung môi phân cực vừa và t−ơng đối phân cực. Chính vì thế mà l−ợng flavonoit có trong phấn hoa tập trung ở dịch chiết metanol và l−ợng ít hơn ở trong dịch chiết etylaxetat, và hầu nh− không có ở dịch chiết n-hexan. Khả năng chống oxi hoá có thể mạnh hơn nếu hàm l−ợng flavonoit cao hơn. Do đó các phân đoạn chứa nhiều flavonoit sẽ có khả năng chống oxi hoá tốt hơn. Nh− vậy, phấn hoa có khả năng chống oxi hoá khá tốt. Con ng−ời có thể sử dụng phấn hoa cho mục đích chống oxi hoá nh− một thực phẩm chức năng.
Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài “nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của sữa ong chúa và phấn hoa” đã thu đ−ợc các kết quả nh− sau:
1. Xác định đ−ợc hàm l−ợng protein có trong sữa ong chúa là 13,1% t−ơng đối cao so với các thành phẩm khác thu đ−ợc từ ong.
2. Xác định đ−ợc 17 axít amin có mặt trong sữa ong chúa bao gồm nhiều axít amin thiết yếu.
3. Phân lập và xác định cấu trúc đ−ợc 2 hợp chất, trong đó chất 1 đ−ợc phân lập từ sữa ong chúa là 10-HDA (axít 10 - Hydroxy - 2- decenoic) và hợp chất 2 đ−ợc phân lập từ phấn hoa là 7 - O - β- Xyloside - naringenin.
4. Đã thử đ−ợc hoạt tính độc tế bào với sữa ong chúa cho kết quả sữa ong chúa có khả năng ức chế các tế bào ung th−.
5. Đã thử hoạt tính chống oxi hoá của phấn hoa cho kết quả là phấn hoa có hoạt tính chống oxi hoá tốt, và có hoạt tính tốt nhất là dịch chiết của phấn hoa trong metanol.
Kiến Nghị
1. Tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất khác có hoạt tính có trong sữa ong chúa và phấn hoa.
2. Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn các hoạt tính sinh học nh− hoạt tính gây độc lên các dòng tế bào khác, hoạt tính chống oxi hoá, thử các hoạt tính trên chuột, vi sinh vật... của sữa ong chúa, phấn hoa, các dịch chiết từ hai đối t−ợng trên.
Tài liệu tham khảo
tiếng việt
1. Nguyễn Bá, (2007), “Hình thái học thực vật”, Nhà xuất bản Giáo dục.
2. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Ch−ơng, Nguyễn Th−ợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn, (2004), Cây
thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ
thuật Hà Nội, tập I, trang 827-828.
3. Nguyễn Hữu Đính, Đỗ Đình Rãng, (2003), “Hoá học hữu cơ 1”, Nhà xuất bản Giáo dục.
4. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị áng, (2009), Hoá Sinh học, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
tiếng anh
5. Agrawal P.K., (1989), “Carbon - 13 NMR of flavonoids”, Elsevier Science Pub.B.V,.
6. Anna Gloria Sabatini, Gian Luigi Marcazzan1, Maria Fiorenza Caboni, Stefan Bogdanov, Ligia Bicudo de Almeida-Muradian, (2009), “Quality and standardisation of Royal Jelly”, Journal of ApiProduct and
ApiMedical Science 1(1): 16-21.
7. Antinelli, J. F., Zeggane.S., Davico.R., Rognone.C., Faucon.J P., Lizzani.L., (2003), “Evaluation of (E)-10-hydroxydec-2- enoic acid as a freshness parameter for royal jelly”. Food Chemistry 80: 85-89.
8. Aziza A. El-Nekeety, Wafaa El-Kholy, Naglaa F. Abbas, Ahmad Ebaid, Hassan A. Amraa, Mosaad A. Abdel-Wahhaba, (2007), “Efficacy of
royal jelly against the oxidative stress of fumonisin in rats”, Toxicon 50, p. 256–269.
9.Barth, O.M, Luz, C.F.P., (1998). “Melissopalynological data obtained from a mangrove area near to Rio de Janeiro”, Brazil. Journal of Apicultural
Research 37 (2), 155–163.
10. Benfenati, L; Sabatini, A G; Nanetti, A (1986) “Composizione in sali minerali della gelatina reale”, Apicoltura 2: 129-143.
11. Boselli. E., Caboni. M F., Sabatini. A G., Marcazzan. G L., Lercker. G., (2003), “Determination and changes of free amino acids in royal jelly during storage”. Apidologie 34: 1-7.
12. Campos M, Cunha A and Markham KR. (1996). “Beepollen composition, properties, and applications. In: Mizrahi A AND LENSKY Y (Eds), Bee products”. Plenum Press: New York.
13. Campos M, Markham KR, Mitchell KA and Da Cunha A, (1997), “An approach to be properties of bee pollen via flavonoid/phenolic profiles”
Phytochem Anal 8: 181-185.
14. Chen, C., Chen, S., (1995), “Changes in protein components and storage stability of royal jelly under various conditions”. Food Chemistry 54, 195–200.
15. Cheng PC., Wong G., (1996) “Honey bee propolis: prospects in medicine”. Bee World; 77:8-14.
16. Colin C.Lucas, (1942), “Chemical Fxamination of Royal jelly”, The
Canadian medical association journal, 406-409.
17. Crane, E., (1990), “Bees and Beekeeping—Science, Practice and World
18. Dinesh Simkhada, EuiMin Kim, Hei Chan Lee, and Jae Kyung Sohng, (2009), “Metabolic Engineering of Escherichia coli for the Biological Synthesis of 7-O-Xylosyl Naringenin”, Mol. Cells 28: 397-401
19. Dragana Vucevic , Eleni Melliou, Sasa Vasilijic, Sonja Gasic, Petar Ivanovski ,Ioanna Chinou , Miodrag Colic, (2007), “Fatty acids isolated from royal jelly modulate dendritic cell-mediated immune response in vitro”, International Immunopharmacology.
20. Dutra, V.M.L., Barth, O.M., (1997). “Anlalise palinol ogica de amostras de mel da regiao de Bananal (SP/RJ)”, Brasil. Revista Universidade de
Guarulhos, Geociencias II, Numero especial: 174–183.
21. Erem C, Deger O, Ovali E, Barlak Y, (2006) , “The effects of royal jelly on autoimmunity in Graves' disease”. Endocrine 30(2):175-83.
22. Ferioli, F; Marcazzan, G L; Caboni, M F, (2007), “Determination of (E)- 10-hydroxy-2-decenoic acid content in pure royal jelly: a comparison between a new CZE method and HPLC”, Journal of separation Science
30: 1061 – 1069
23. Gohan Eraslan, Murat Kanbur, Sibel Silici, (2009), “Effect of carbaryl on some biochemical changes in rats: The ameliorative effect of bee pollen”,
Food and Chemical Toxicology 47: 86–91.
24. Graham, J. (ed.) (1992), “The Hive and the Honey Bee” (Revised Edition). Dadant & Sons.
25. Harborn J.B., (1994), “The flavonoids advance in research since 1986”,
Chapman & Hall,.
26. Hattori N, Nomoto H, Fukumitsu H, Mishima S, Furukawa S, (2007) , “Royal jelly and its unique fatty acid, 10-hydroxy-trans-2-decenoic acid,
promote neurogenesis by neural stem/progenitor cells in vitro”. Biomed Res. 28(5):261-6.
27. Hayerman A.E., Butler I.G., (1994), “Assay of caondensed tanin or flavonoid oligomers and related flavonoid in plant”, Meth, Enz, 234: 249.
28. Hiroko Tani, Shunya Takahashi, Keiko Hasumi, Tomoki Tatefuji, Yayoi Hongo, Hiroyuki Koshino, (2009), “Isolation of (E)-9,10-dihydroxy-2- decenoic acid from royal jelly and determination of the absolute configuration by chemical synthesis”, Tetrahedron: Asymmetry 20: 457– 460.
29. Iannuzzi J.,(1990), “Royal Jelly: mystery food, in three parts”. Am Bee J , 8:532-4, 587-9, 659-62.
30. Illana Louise Pereira de Melo; Ligia Bicudo de Almeida – Muradian, (2010), “Stability of antioxidants vitamins in bee pollen samples”’ Faculdade de Ciencias Farmacouticas. Universidade se Soo paulo, Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bl. 14, 05: 508-900 Sao Paulo - SP, Brasil.
31. Iwao Okamoto, Yoshifumi Taniguchi, Toshio Kunikata, Keizo Kohno, Kanso Iwaki, Masao Ikeda, Masashi Kurimoto, (2003), “Major royal jelly protein 3 modulates immune responses in vitro and in vivo” , Life
Sciences 73: 2029–2045.
32. Jean-Claude Dauguet, Maryse Bert, Jean Dolley, Anain bekaer, Guy Lenwin, (1993), “8-Methoxykaempferol 3-neohesperidoside and other flavonoids from bee pollen or crataegus monogyna” , Phytochemistr Vol 33,(6): 1503-1505.
33. Krell R. (1996) “Value-added products from bee keeping”. FAO
34. Krell, R., (1996). “Value-added products from beekeeping”. FAO Agricultural Services Bulletin 124, Food and Agriculture Organization,
Rome: 87–113.
35. L.A. Salazar-Olivo, V. Paz-Gonzalez, (2005), “Screening of biological activities present in honeybee (Apis mellifera) royal jelly”, Toxicology in
Vitro (19): 645–651.
36. L.B. Almeida-Muradian, Lucila C. Pamplonaa, S!ılvia Coimbra, Ortrud Monika Barth, (2005) “Chemical composition and botanical evaluation of dried bee pollen pellets”, Journal of Food Composition and Analysis 18: 105–111.
37. Laura silvia G. V.,Norma A. A., et al, (2007), “Antioxidant activity of polyphenolic extract of monofloral honeybeecollected pollen from mesquite (Prosopis juliflora, Leguminosae)”, Journal of Food
Composition and Analysis 20: 119–124
38. Lecker G, et al. (1982), “Components of royal jelly II: the lipid fraction, hydrocarbons and sterols”. J Apic Res 21:178-84.
39. Lercker. G., Caboni. M F., Vecchi. M A., Sabatini. A G., Nanetti. A., (1993), “Caratterizzazione dei principali costituenti della gelatina reale”,
Apicoltura 8: 27-37.
40. Lercker, G., Capella, P., Conte, L.S., Ruini, F., Giordani, G., (1981). “Components of royal jelly”, I. Identification of the organic acids. Lipids
12: 912–919.
41. Liang Guang-Yi, Alexander I. Gray and Peter G. Waterman, (1989), “Pentacyclic triterpenes from the fruits of Rosa sterilis”, Journal of
42. Liviu A. Marghitas, Oltica G. Stanciu, Daniel S. Dezmirean, Otilia Bobis, Olimpia Popescu, Stefan Bogdanov, Maria Graca Campos, (2009), “In vitro antioxidant capacity of honeybee-collected pollen of selected floral origin harvested from Romania”, Food Chemistry 115: 878–883.
43. Luz, C.F.P., Barth, O.M., (2001). “Melissopalynological observations in a mangrove area next to Rio de Janeiro, Brazil”. In: Goodman, D.K., Clarke, R.T. (Eds.), Proceedings of the IX Palynological Congress. American Association of Stratigraphic Palynologists Foundation, Houston, pp. 489–492.
44. Mabry F.J., Markman R.B., Thomas M.B., (1970), “The syrematic identification of flavonoids”, Springer Verlag - Berlin - Heidelberg - New York.
45. Murat Kucuk, Sevgi Kolayl, Sengul Karaoglu, Esra Ulusoy, Cemalettin Baltacı, Ferda Candan, (2007), “Biological activities and chemical composition of three honeys of different types from Anatolia”, Food
Chemistry 100 (2007): 526–534.
46. Naoki Noda, Kazue Umebayashi, Takafumi Nakatani, Kazumoto Miyahara, and Kaori Ishiyama, (2005), “Isolation and Characterization of Some Hydroxy Fatty and Phosphoric Acid Esters of 10-Hydroxy-2- decenoic Acid from the Royal Jelly of Honeybees (Apis mellifera)” ,
Lipids 40: 833–838.
47. Pleasants, Jm; Hellmich, Rl; Dively, Gp; Sears, Mk; Stanley-horn, De; Mattila, Hr; Foster, Je; Clark, P et al. (October 2001). "Corn pollen deposition on milkweeds in and near cornfields" , Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 98 (21):
48. S. B. Mahato and A. P. Kundu, (1994), “13C-NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-A compilantion and some salient features”, Phytochemistry, Vol. 37: 1517-1575.
49. S. P. Shrivastava, (1982), “A flavanone glycoside from PR Unus
Cerasoides”, PhytochemistryVol. 21, No. 6: 1464-1465.
50. Shougo Tamura, Toru Kono, Chika Harada, Kikuji Yamaguchi, Takanori Moriyama, (2009), “Estimation and characterisation of major royal jelly proteins obtained from the honeybee Apis merifera” , Food Chemistry
114: 1491–1497
51. Takashi Echigo, Tetsuo Takenaka and Kazuhisa Yatsunami, (1986), “Comparative Studies on chemical composition of Honey, Royal Jelly and Pollen Loads”, Bull. Fac. Agr., Tamagawa. No.26: 1-12.
52. Tania Maria Sarmento Silva, Celso Amorim Camara, Antonio Claudio da Silva Lins, Jose Maria Barbosa-Filho, Eva Monica Sarmento da Silva, Breno Magalhaes Freitas, Francisco de Assis Ribeiro dos Santos, (2006), “Chemical composition and free radical scavenging activity of pollen loads from stingless bee Melipona subnitida Ducke”, Journal of Food
Composition and Analysis 19: 507–511.
53. Tania Maria Sarmento Silvaa, Celso Amorim Camaraa, Antonio Claudio da Silva Linsa, Jose´ Maria Barbosa-Filhoa, Eva Moˆ nica Sarmento da Silvab, Breno Magalha˜ es Freitasb, Francisco de Assis Ribeiro dos Santos, (2006), “Chemical composition and free radical scavenging activity of pollen loads from stingless bee Melipona subnitida Ducke”,
Journal of Food Composition and Analysis 19: 507–511.
54. Ternai B., Markham K.R., (1976), “C13 - NMR of flavonoids - I – Flavones and flavonols”. Tetrehedron 32:pp 565.
55. Tomaslorente. F., Garciagrau MM, Nieto JL and Tomasbarberan FA, (1992). “Flavonoids from CistusLadanifer bee pollen” , Phytochemistry
31: 2027-2029.
56. Tetsuya Kodai, Kazue Umebayashi, Takafumi Nakatani, Kaori Ishiyama, and Naoki Noda, (2007), “Compositions of Royal Jelly II. Organic Acid