3.1. Giới hán phát hieơn
Giới hán phát hieơn là maơt đoơ tê bào thâp nhât cụa vi sinh vaơt múc tieđu mà phương pháp có khạ naíng phát hieơn được trong mău so với phương pháp chuaơn. Giới hán phát hieơn là thođng sô quan trĩng quyêt định phương pháp được thiêt laơp có đáp ứng được yeđu caău thực tê hay
khođng. Trong luaơn vaín này giới hán phát hieơn cụa qui trình phát hieơn E. coli trong thực phaơm được khạo sát tređn 4 chụng E. coli có nguoăn gôc khác nhau, moêi chụng được thực hieơn tređn 5 mău đái dieơn cho 5 nhóm thực phaơm. Moêi lối mău được gađy nhieêm với các maơt đoơ E. coli 3CFU, 8CFU, 15CFU và 36CFU/g mău và laịp lái 2 laăn. Tiên hành phađn tích các mău đã gađy
nhieêm baỉng 2 phương pháp PCR và nuođi cây. Kêt quạ được trình bày ở Bạng 7 và Hình 18
Bạng 7. Kêt quạ khạo sát giới hán phát hieơn cụa quy trình PCR xét nghieơm E. coli trong
thực phaơm Laăn Maơt đoơ gađy nhieêm (CFU/g) Phương pháp
Mău gađy nhieêm Thịt Cá Bánh Sữa tươi Cà chua 1 0 Nuođi cây _ _ _ _ _ PCR _ _ _ _ _ 3 Nuođi cây + + - + + PCR + + - + + 8 Nuođi cây + + + + + PCR + + + + + 15 Nuođi cây + + + + + PCR + + + + + 36 Nuođi cây + + + + + PCR + + + + + 0 Nuođi cây _ _ _ _ _ PCR _ _ _ _ _ 3 Nuođi cây + + + + + PCR + + + + + 8 Nuođi cây + + + + +
2 PCR + + + + +
15 Nuođi cây + + + + +
PCR + + + + +
36 Nuođi cây + + + + +
PCR + + + + +
Ở maơt đoơ gađy nhieêm 3CFU/g mău thì cạ hai phương pháp đeău cho kêt quạ dương tính ở 4 lối mău. Mău bánh bođng lan gađy nhieêm laăn 1 cho kêt quạ ađm tính ở cạ hai phương pháp nhưng laăn 2 cho kêt quạ dương tính, có lẽ do laăn 1 vieơc gađy nhieêm khođng thành cođng. Như vaơy giới hán phát hieơn này là 3CFU/g mău thực phaơm sau khi qua bước taíng sinh trong mođi trường TSB ở 37C trong 20 giờ. Tuy giới hán phát hieơn cụa 2 phương pháp là tương đương nhau nhưng rõ ràng phương pháp PCR có hieơu quạ hơn so với phương pháp nuođi cây vì có thời gian phát hieơn ngaĩn hơn, chư sau khoạng 24 giờ keơ từ khi phađn tích. Trong khi đó phương pháp nuođi cây cho kêt quạ sau ít nhât 3 ngày.
Hình 18. Kêt quạ đieơn di khạo sát giới hán phát hieơn
cụa quy trình PCR xét nghieơm E. coli trong thực phaơm
1: Thang 100bp; 2, 3, 4 ,5, 6: mău thịt, cá, bánh, sữa và cà chua gađy nhieêm ở maơt đoơ 3CFU/g; 7, 8, 9,10, 11: mău thịt, cá, bánh, sữa và cà chua gađy nhieêm ở maơt đoơ 8CF/g
3.2. Xác định các thođng sô kĩ thuaơt tương đôi cụa phương pháp PCR so với phương pháp nuođi cây
Đeơ đánh giá các thođng sô kĩ thuaơt cụa phương pháp PCR so với phương pháp nuođi cây chúng tođi tiên hành chĩn các mău đái dieơn cho các nhóm thực phaơm khác nhau. Thí nghieơm
được tiên hành tređn 66 mău, trong đó có 33 mău được gađy nhieêm E. coli với maơt đoơ 3 CFU/g mău (các mău này trước khi gađy nhieêm đã được khẳng định là ađm tính với E. coli). Tât cạ các
mău tređn được phađn tích đoăng thời baỉng 2 phương pháp nuođi cây và PCR. Kêt quạ phađn tích được trình bày tređn Bạng 8.
Bạng 8. Kêt quạ phađn tích E. coli tređn các lối mău thực phaơm có và khođng gađy nhieêm E. coli
baỉng phương pháp truyeăn thông và phương pháp PCR STT Teđn mău Mău gađy nhieêm Mău khođng gađy nhieêm PCR Nuođi cây PCR Nuođi cây
1 Xúc xích tođm + + _ _ 2 Xúc xích heo + + _ _ 3 Xúc xích bò + + _ _ 4 Heo 2 lát + + _ _ 5 Thịt bò hoơp + + _ _ 6 Thịt gà haăm + + _ _ 7 Cá vieđn + + _ _ 8 Khođ mực + + _ _ 9 Cá basa + + _ _ 10 Cá trích sôt cà + + _ _ 11 Chạ lúa + + _ _ 12 Cá ngừ sôt cà + + _ _ 13 Nâm rơm + + _ _ 14 Xà lách son + + _ _ 15 Cại ngĩt + + _ _ 16 Đaơu que + + _ _
17 Rau deăn + + _ _ 18 Chuôi + + _ _ 19 Đaơu hụ + + _ _ 20 Sữa tươi + + _ _ 21 Sữa đaịc + + _ _ 22 Sữa chua + + _ _ 23 Bơ + + _ _ 24 Cà pheđ sữa + + _ _ 25 Phomai + + _ _ 26 Bánh bođng lan + + _ _ 27 Bánh AFC + + _ _ 28 Nước cam + + _ _ 29 Nho + + _ _ 30 Trứng gà + + _ _ 31 Trứng vịt + + _ _ 32 Trứng cút + + _ _ 33 Cà chua + + _ _
Từ kêt quạ tređn Bạng 8 có theơ tóm taĩt sự tương quan giữa các kêt quạ phađn tích baỉng phương pháp PCR và phương pháp nuođi cây như Bạng 9.
Bạng 9. Sự tương qua giữa các kêt quạ phađn tích baỉng phương pháp nuođi cây và PCR
Phương pháp nuođi cây
Phương pháp PCR
Mău dương tính Mău ađm tính Toơng Mău dương tính N11 = 33 N12 = 0 C = N11 + N12 = 33 Mău ađm tính N21 = 0 N22 = 33 D = N21 +N22 =33 Toơng kêt quạ A = N11 + N21 = 33 B = N12 + N22 = 33 N = 66
Từ các dữ kieơn tređn Bạng 9, các thođng sô kĩ thuaơt tương đôi giữa phương pháp PCR và phương pháp nuođi cây có theơ được tính như sau:
- Đoơ chính xác tương đôi: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
RA (%) = ( N11 + N22) x 100 / N = ( 33 + 33) x 100 / 66 = 100% - Tư leơ dương tính giạ:
FP (%) = N21 x 100 / D = 0 x 100 / 33 = 0% - Tư leơ ađm tính giạ:
FN (%) = N12 x 100 / D = 0 x 100 / 33 = 0% - Đoơ nháy tương đôi :
RS-P (%) = N11 x 100 / C = 33 x 100 / 33 = 100% - Đoơ đaịc hieơu tương đôi:
RS-N (%) = N22 x 100 / D = 33 x 100 / 33 = 100% - Đoơ khác bieơt có ý nghĩa cụa 2 phương pháp :
2 = ((N12 - N21) - 1) 2/ ( N12 + N21) với baơc tự do df = 1 2 = (( 0 - 0 ) - 1 )2 / ( 0 - 0 ) =
Các thođng sô tređn cho thây phương pháp PCR đeơ phát hieơn E. coli có kêt quạ đáng tin caơy
với đoơ nháy tương đôi là RS = 100% thõa mãn giới hán châp nhaơn cụa tieđu chuaơn AOAC và Nordl ( RS 95%). Khođng có trường hợp ađm tính giạ và dương tính giạ đôi với 33 mău gađy nhieêm. Giá trị cụa các thođng sô khác như đoơ đaịc hieơu tương đôi, đoơ chính xác tương đôi đeău đát 100% và giá trị 2 = > 3,84 cho thây khođng có sự khác bieơt khi phađn tích E. coli trong thực phaơm baỉng phương pháp PCR hay nuođi cây. Nói cách khác kêt quạ phađn tích E. coli
3.3. Đánh giá đoơ laịp lái
Múc đích cụa khạo sát này đeơ đánh giá mức đoơ oơn định cụa phương pháp trong thao tác thực hieơn qui trình phađn tích. Thí nghieơm được laịp lái 10 laăn tređn moơt dịch mău đã xử lý với cùng moơt đieău kieơn, thành phaăn phạn ứng, tái cùng moơt thời đieơm. Kêt quạ được theơ hieơn ở Hình 19.
Hình 19. Kêt quạ đieơn di khạo sát đoơ laịp lái cụa phạn ứng PCR
1: Thang 100bp, 2: Vách chuaơn 299bp; 3-12: sạn phaơm khuêch đái E. coli trong 10 laăn laịp lái.
Kêt quạ tređn cho thây tât cạ các laăn laịp lái đeău cho kêt quạ dương tính. Như vaơy có theơ kêt luaơn raỉng phương pháp PCR có tính oơn định cao, deê dàng thao tác. Kêt quạ này sẽ táo thuaơn lợi cho vieơc trieơn khai phương pháp PCR đên các phòng thí nghieơm khác.
3.4. Đánh giá đoơ oơn định
- Khạo sát giới hán dao đoơng nhieơt đoơ baĩt caịp cho phép: đeơ xác định giới hán dao đoơng nhieơt đoơ baĩt caịp cho phạn ứng PCR, chúng tođi tiên hành khạo sát ở các nhieơt đoơ là 50oC, 52oC, 55oC, 58oC, 60oC và 62oC. Kêt quạ được theơ hieơn tređn Bạng 10 và Hình 20.
Bạng 10. Giới hán dao đoơng cụa nhieơt đoơ baĩt caịp cho phép
trong phạn ứng PCR
Hình 20. Kêt quạ đieơn di khạo sát giới hán dao đoơng nhieơt đoơ baĩt caịp cho phép cụa phạn
ứng PCR
1: Vách 299bp chuaơn; 2: 50, C; 3: 52C; 4: 55C; 5: 58C; 6: 60C ;7: 62C
Kêt quạ tređn cho thây ở nhieơt đoơ 50C, 52C, 55, 58C, 60C và 62C đeău cótín hieơu
khuêch đái.Vì vaơy dao đoơng nhieơt đoơ baĩt caịp cho phép trong phạn ứng PCR đeơ phát hieơn E. coli
là 50 - 62C.
Nhieơt đoơ 500C 520C 550C 580C 600C 620C
Kêt quạ PCR + + + + + +
- Khạo sát giới hán dao đoơng noăng đoơ Mg2+ cho phép: chúng tođi tiên hành phạn ứng PCR với các noăng đoơ Mg2+ là 1 – 4mM. Các thành phaăn khác cụa phạn ứng khođng thay đoơi. Kêt quạ
khạo sát được trình bày ở Bạng 11 và Hình 21.
Bạng 11. Giới hán dao đoơng cho phép cụa noăng đoơ Mg2+ trong phạn ứng PCR
Noăng đoơ Mg2+ (mM) 1 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4
Kêt quạ PCR + + + + + + + (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 21. Kêt quạ đieơn di khạo sát giới hán dao đoơng cho phép cụa noăng đoơ Mg2+ trong phạn ứng PCR
1:Vách 299 bp chuaơn; 2: 1mM Mg2+; 3:1,5mM Mg2+; 4: 2,0mM Mg2+; 5: 2,5mM Mg2; 6: 3mM Mg2+; 7: 3,5mM Mg2+; 8: 4,0mMg2+
Kêt quạ tređn Hình 21 cho thây noăng đoơ Mg2+ từ 1mM đên 4mM đeău cho kêt quạ khuêch đái dương tính. Như vaơy noăng đoơ Mg2+ dao đoơng cho phép trong khoạng từ 1- 4mM.
- Khạo sát giới hán dao đoơng noăng đoơ moăi cho phép : Noăng đoơ moăi trong moơt phạn ứng quyêt định sô lượng bạn sao cụa DNA múc tieđu trong quá trình khuêch đái. Noăng đoơ moăi quá cao sẽ cho sạn phaơm khuêch đái khođng đaịc hieơu, ngược lái noăng đoơ moăi quá thâp sẽ cho ít sạn phaơm khuêch đái, khó phát hieơn trong quá trình đieơn di, deê gađy neđn kêt quạ ađm tính giạ. Trong khạo sát này chúng tođi thay đoơi noăng đoơ moăi cho moơt phạn ứng trong khoạng 1,25 -10 pmol. Kêt quạ khạo sát được trình bày tređn Bạng 12 và Hình 22.
VMoăi/pư(pM) 0,2 0,41 0,63 0,83 1 1,5 1,7 Noăng đoơ moăi 1,25pM 2,5pM 3,75pM 5pM 6,25pM 7,5pM 8,75pM
KQ PCR - + + + + - -
Kêt quạ ở Bạng 12 và Hình 22 cho thây noăng đoơ moăi 1,25pM, 7,5pM và 8,75pM khođng cho sạn phaơm khuêch đái. Các noăng đoơ từ 2,5 – 6,25 đeău cho sạn phaơm khuêch đái. Vaơy giới
hán dao đoơng cho phép cụa noăng đoơ moăi là 2,5pM – 6,25 đeơ phát hieơn E. coli baỉng phương pháp
PCR.
Hình 22. Kêt quạ đieơn di khạo sát giới hán dao đoơng cho phép cụa noăng đoơ moăi trong phạn
ứng PCR
1:Vách 299 bp chuaơn; 2: 1,25pM; 3: 2,5pM; 4: 3,75pM; 5: 5pM; 6: 6,25pm; 7: 7,5pM; 8: 8,75pM.
- Khạo sát giới hán dao đoơng cho phép cụa noăng đoơ Taq: Taq DNA polymerase là thành phaăn khođng theơ thiêu cụa phạn ứng khuêch đái nhưng được sử dúng với hàm lượng rât nhỏ neđn sự sai sô do dúng cú kĩ naíng thao tác là khó tránh khỏi. Đeơ đánh giá giới hán sai sô cho phép veă noăng đoơ enzym này trong phạn ứng chúng tođi tiên hành khạo sát các noăng đoơ dao đoơng trong khoạng 0,5 - 2,0l/ phạn ứng. Kêt quạ được trình bày trong Bạng 13 và Hình 23.
Bạng 13. Giới hán dao đoơng cho phép cụa noăng đoơ Taq trong phạn ứng PCR Theơ tích Taq DNA polymerase 1U ( l) 0,5 1,0 1,5 2,0
Kêt quạ PCR + + + +
Hình 23. Kêt quạ đieơn di khạo sát giới hán dao đoơng cho phép cụa noăng đoơ Taq DNA polymerase
1: Vách 299bp chuaơn ; 2: 0,5U Taq; 3: 1,0U Taq; 4: 1,5U Taq; 5 : 2,0U Taq
Kêt quạ tređn Bạng 12 và Hình 23 cho thây noăng đoơ enzym Taq polymerase trong moơt phạn ứng thay đoơi 0,5 - 2,0l tương ứng với 1 - 4U mà khođng ạnh hưởng đên kêt quạ khuêch đái.
Các kêt quạ phađn tích đoơ oơn định cụa phạn ứng PCR đeơ phát hieơn E. coli baỉng caịp moăi
EC theo quy trình đã được thiêt laơp cho thây, quy trình và phạn ứng này rât oơn định, cho phép các dao đoơng khá lớn do thao tác khi phôi troơn các thành phaăn phạn ứng.