THIÊT LAƠP QUI TRÌNH PCR PHÁT HIEƠN E COLI BAỈNG CHỤNG CHUAƠN 1 Thời gian xử lý nhieơt trích khuođn DNA

2.1. Thời gian xử lý nhieơt trích khuođn DNA

Các khạo sát trước đađy cho thây có theơ đun cách thụy đeơ phá tê bào giại phóng DNA dùng làm khuođn cho phạn ứng PCR. Đeơ xác định thời gian xử lý tôt nhât chúng tođi tiên hành khạo sát xử lý baỉng nhieơt ở các thời gian khác nhau trong khoạng 10 – 40 phút. Dịch sau khi xử lý được dùng làm khuođn đeơ thực hieơn phạn ứng PCR. Kêt quạ được trình bày ở Hình10.

Hình 10. Kêt quạ khạo sát thời gian đun cách thụy đeơ phá vỡ tê bào giại phóng DNA

boơ gen vi khuaơn

1: Vách 299bp chuaơn; 2: 10 phút ;3: 20phút; 4: 30 phút; 5: 40 phút

Kêt quạ đieơn di cho thây từ giêng 2 đên giêng 6, phạn ứng PCR cho sạn phaơm khuêch đái có đoơ dài baỉng với sạn phaơm chuaơn ở tât cạ các trường hợp xử lý dịch tê bào baỉng nhieơt pháp xử lý baỉng nhieơt. Ở các khoạng thời gian xử lý nhieơt khác nhau đeău cho tín hieơu đái rõ nét do vaơy đeơ tiêt kieơm thời gian chúng tođi chĩn thời gian xử lý đeơ phá vỡ tê bào giại phóng khuođn DNA là 10 phút.

2.2. Khạ naíng khuêch đái cụa caịp moăi EC

Khi thực hieơn phạn ứng khuêch đái với caịp moăi EC cho 6 chụng E. coli có nguoăn gôc

khác nhau, kêt quạ đieơn di cho thây các giêng có các vách với kích thước 299bp. Như vaơy caịp moăi EC có khạ naíng khuêch đái đốn DNA đúng kích thước 299pb (Hình 11).

Hình 11. Khạ naíng khuêch đái cụa caịp moăi EC

1: Thang 100pb chuaơn ; 2, 3, 4, 5, 6, 7 các chụng E. coli khác nhau

2.3. Khạo sát tính chuyeđn bieơt cụa caịp moăi EC

Tính chuyeđn bieơt cụa phương pháp PCR trong phát hieơn E. coli chính là tính chuyeđn bieơt

hành thí nghieơm tređn 6 chụng E. coli có nguoăn gôc khác nhau và 9 chụng vi sinh vaơt khác. Các

chụng vi sinh vaơt này được nhaơn từ Phòng thí nghieơm Cođng ngheơ Sinh hĩc phađn tử, Trường ĐH Khoa hĩc tự nhieđn, Đái hĩc Quôc gia Tp Hoă Chí Minh, Đái hĩc RMIT (Úc) và Vieơn Pasteur Tp Hoă Chí Minh. Kêt quạ được trình bày tređn Bạng 4 và Hình 12.

Hình 12. Kêt quạ khạo sát tính chuyeđn bieơt cụa caịp moăi EC

1: Thang 100bp; 2, 3, 4, 5, 6, 7 chụng E. coli; 8: Salmonella typhimurinum; 9: Listeria monocytogenes; 10: Virio cholerae; 11: Virio parahaemotylicus;

12: Bacielus cereus; 13: Staphylococus aureus; 14: Shigella sonnei; 15: Clostridium botulinum; 16: Clostridium perfringens.

Bạng 4. Kêt quạ khạo sát chuyeđn bieơt cụa phương pháp PCR

phát hieơn E. Coli

STT Teđn chụng Nguoăn gôc Sô chụng Sô kêt quạ dương tính

1 Escherichi coli RMIT, Úc 2 2

2 Escherichia coli Vieơn Pasteur TP HCM 1 1

3 Escherichia coli Phađn laơp từ thực phaơm 3 3

4 Salmonella typhimurinum

TTKHCNSH 1 0

5 Listeria monocytogenes TTKHCNSH 1 0 6 Vibrio cholerae TTKHCNSH 1 0 7 Vibrio parahaemolyticus TTKHCNSH 1 0 8 Bacilus cereus TTKHCNSH 1 0 9 Staphylococus aureus TTKHCNSH 1 0 10 Shigella sonnei TTKHCNSH 1 0 11 Clostridium botulinum TTKHCNSH 1 0 12 Clostridium perfringens TTKHCNSH 1 0

Kêt quạ khạo sát cho thây phạn ứng PCR với caịp moăi EC chư cho sạn phaơm khuêch đái

có đoơ dài 299 bp tređn các chụng E. coli; các vi sinh vaơt khác đeău cho kêt quạ ađm tính với caịp moăi này. Như vaơy có theơ kêt luaơn caịp moăi EC là đaịc trưng cho E. coli chư cho sạn phaơm khuêch đái 299 bp với các chụng E. coli.

2.4. Các đieău kieơn tôi ưu cụa phạn ứng PCR

- Nhieơt đoơ baĩt caịp giữa moăi và khuođn: nhieơt đoơ baĩt caịp giữa moăi và khuođn là yêu tô quan trĩng quyêt định kêt quạ PCR. Kêt quạ khạo sát cho thây trừ trường hợp nhieơt đoơ 67oC, các trường hợp 50 -62C phạn ứng đeău cho sạn phaơm khuêch đái 299pb nhưng kêt quạ 58C cho kêt quạ tôt nhât (giêng 5). Như vaơy 58C được xem là nhieơt đoơ tôi ưu cho moăi baĩt caịp và khuođn (Hình 13).

Hình 13. Nhieơt đoơ baĩt caịp giữa moăi và khuođn tôi ưu cụa phạn ứng PCR

1: Vách chuaơn; 2: 500C; 3: 53C; 4: 55C; 5: 58C ,6: 62C; 7: 67C

- Noăng đoơ moăi: khạo sát noăng đoơ moăi nhaỉm múc đích tôi ưu hoá hàm lượng moăi EC trong phạn ứng PCR. Chúng tođi tiên hành khạo sát ở các noăng đoơ moăi khác nhau là 5,5; 6 và 6,5pM/phạn ứng cho moêi moăi. Kêt quạ được theơ hieơn tređn Hình 14.

Hình 14. Khạo sát noăng đoơ moăi tôi ưu cụa phạn ứng PCR

1: Vách chuaơn; 2: 5,5pM; 3: 3: 6pM; 4: 6,5pM

Kêt quạ tređn cho thây noăng đoơ moăi từ 5,5 – 6,5 đeău cho tín hieơu khuêch đái. Tuy nhieđn tính hieơu khuêch đái rõ nhât ở vách 6pM (giêng 3). Do đó chúng tođi chĩn noăng đoơ moăi 6pM/phạn ứng là noăng đoơ moăi thích hợp nhât cho phạn ứng PCR.

299bp

- Noăng đoơ Mg2+: ion Mg2+ có tác dúng taíng cường ái lực giữa moăi và khuođn DNA đoăng thời giúp cho Taq DNA polymerase gaĩn dNTP vào moăi trong giai đốn kéo dài. Vì vaơy nêu hàm lượng Mg2+ trong phạn ứng quá cao sẽ khođng cho sạn phaơm khuêch đái hay sạn phaơm khuêch đái khođng đaịc hieơu. Ngược lái, nêu hàm lượng ion này quá thâp sẽ khođng cho hay cho quá ít sạn phaơm khuêch đái, khođng theơ phát hieơn được khi đieơn di. Trong khạo sát này, chúng tođi tiên hành thay đoơi hàm lượng ion Mg2+ dao đoơng trong khoạng 2 - 4mM trong moơt phạn ứng. Kêt quạ khạo sát được theơ hieơn tređn Hình 15.

Hình 15. Noăng đoơ Mg2+ tôi ưu cụa phạn ứng PCR

1: Vách chuaơn; 2: 2mM; 3: 2,5mM; 4: 3mM; 5: 3,5mM; 6: 4mM

Kêt quạ tređn Hình 15 cho thây ở tât cạ các phạn ứng PCR đeău cho sạn phaơm khuêch đái. Tuy nhieđn sạn phaơm khuêch đái tôt nhât khi thực hieơn với noăng đoơ Mg2+ là 3mM/phạn ứng. Đađy được xem là noăng đoơ tôi ưu cho phạn ứng PCR. Tuy nhieđn đeơ đoăng nhât với các qui trình phát hieơn vi sinh vaơt trong thực phaơm baỉng PCR chúng tođi chĩn noăng đoơ Mg2+ là 2,5mM đeơ thiêt laơp

qui trình phát hieơn E. coli.

Từ các kêt quạ khạo sát các đieău kieơn tôi ưu cụa phạn ứng PCR neđu tređn chúng tođi chĩn đieău kieơn tôi ưu cụa phạn ứng PCR như sau:

- Chương trình cụa phạn ứng khuêch đái được thiêt laơp với 35 chu kỳ goăm 95C trong 1 phút, 58C trong 45 giađy, 72C trong 1 phút.

- Noăng đoơ moêi moăi EC là 6pmol - Noăng đoơ Mg2+ thích hợp là 2,5mM - Noăng đoơ Taq thích hợp là 0,5l

2.5. Thời gian taíng sinh caăn thiêt đeơ phát hieơn E. coli trong thực phaơm

Đeơ thiêt laơp qui trình phát hieơn E. coli trong thực phaơm, chúng tođi thực hieơn phạn ứng PCR tređn các mău thực phaơm cá, pate và sữa được gađy nhieêm E. coli với maơt đoơ khoạng

10CFU/10g. Nuođi taíng sinh trong tụ âm ở 37C trong 24 giờ. Sau moêi 2 giờ lây 1ml dịch nuođi cây ly tađm thu sinh khôi và huyeăn phù hóa trong TE, xử lý nhieơt và thực hieơn phạn ứng PCR. Các thí nghieơm được laịp lái 3 laăn.

Kêt quạ ở Bạng 5 cho thây ở mău sữa sau 12 giờ taíng sinh đã có theơ phát hieơn E. coli baỉng PCR. Trường hợp mău pate thì caăn 16 giờ taíng sinh. Trường hợp cá gađy nhieêm E.coli caăn đên 20 giờ mới phát hieơn được E.coli. Do vaơy, chúng tođi chĩn thời gian taíng sinh tôi thieơu tređn

Bạng 5. Thời gian taíng sinh tôi thieơu đeơ phát hieơn E. coli trong các mău thực phaơm bị gađy

nhieêm.

Thời gian taíng sinh (giờ) Kêt quạ phạn ứng PCR Cá Pate Sữa 4 - - - 6 - - - 8 - - - 10 - - - 12 - - + 14 - - + 16 - + + 18 - + + 20 + + + 24 + + + Ký hieơu : +, phạn ứng PCR dương tính -, phạn ứng PCR ađm tính

2.6. Xác định đoơ nháy cụa phạn ứng PCR

Đoơ nháy cụa phạn ứng PCR ở đađy được xác định baỉng sô tê bào E. coli tôi thieơu có trong

moơt phạn ứng mà phương pháp PCR có theơ phát hieơn được. Trong khạo sát này, chúng tođi tiên

hành pha loãng baơc 10 dịch tê bào E. coli được taíng sinh trong mođi trường TSB qua đeđm baỉng

dung dịch NaCl 0,85% sao cho có maơt đoơ từ 9 x 101 – 9 x 105 CFU/ml. Dịch tê bào này được dùng đeơ xử lý nhieơt, đeơ thu DNA dùng cho phạn ứng PCR. Bạng 6 và Hình 16 trình bày kêt quạ xác định đoơ nháy cụa phạn ứng PCR.

Bạng 6. Kêt quạ phát hieơn E. coli baỉng phương pháp PCR ở

các maơt đoơ khác nhau

10 -1 10-2 10-3 10-4 10-5 CFU /ml 9. 105 9. 104 9.103 9.102 9.101 CFU / phạn ứng 3. 102 3. 101 3. 100 3. 10-1 3. 10-2

Kêt quạ PCR + + + _ _

Hình 16. Đoơ nháy cụa phạn ứng PCR

1: Thang DNA ; 2: Vách chuaơn 299bp; 3: 9 x 105 CFU/ml; 4: 9 x 104 CFU/ml; 5: 9 x103 CFU/ml; 6: 9 x 102 CFU/ml; 7: 9 x 101CFU/ml

2.7. Quy trình phát hieơn E. coli trong thực phaơm baỉng phương pháp PCR

Caín cứ vào kêt quạ cụa các thí nghieơm tređn, chúng tođi đeă nghị qui trình PCR đeơ phát hieơn

E. coli trong thực phaơm như sau:

- Chuaơn bị mău:

Cađn 10 g thực phaơm vào bao PE vođ trùng, boơ sung 90g Buffered Pepton Water, đoăng nhât và ụ trong tụ âm ở 370C trong 20 giờ. Hút 1ml dung dịch sau khi taíng sinh vào eppendorf, ly tađm với tôc đoơ 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Lối dịch trong beđn tređn, rửa caịn tê bào baỉng 1ml nước cât vođ trùng. Ly tađm đeơ lối bỏ phaăn nước. Huyeăn phù hóa sinh khôi tê bào trong

299bp

Bạng 6 và Hình 16 cho thây phạn ứng PCR cho phép phát

eppendorf với 0,2ml TE, đun sođi cách thụy trong 10 phút. Ly tađm với tôc đoơ 10000 vòng/phút trong 5 phút đeơ lối bỏ các mãnh vỡ tê bào. Phaăn dịch beđn tređn được dùng làm khuođn DNA cho phạn ứng PCR. - Thành phaăn cụa 25l phạn ứng PCR : Đeơm dùng cho phạn ứng PCR ( 10X) 2,5µl dNTP 100µl 2,5µl MgCl2 (25mM) 2,5µl Moăi EC 1 (6pM) 1,0 µl Moăi EC 2 (6pM) 1,0 µl Taq polymerase 1U 0,5µl DNA khuođn 3,0µl Nước cât 12,0µl

- Chương trình cụa phạn ứng khuêch đái: biên tính DNA ở 95C trong 5 phút; phạn ứng PCR goăm 35 chu kỳ, moêi chu kỳ goăm 3 bước biên tính ở 95C trong 1 phút, baĩt caịp cụa moăi với DNA khuođn ở 58C trong 45 giađy, kéo dài ở 72C trong 1 phút. Sau phạn ứng mău được giữ ở 72C trong 10 phút đeơ cho các đốn DNA chưa toơng hợp hoàn chưnh sẽ tiêp túc được toơng hợp đeơ hoàn tât chieău dài cụa chúng. Mău được giữ oơn định ở 4C trong 30 phút trước khi kêt thúc.

- Phađn tích sạn phaơm khuêch đái: sạn phaơm sau khuêch đái được đieơn di tređn gel agarose 1,5% ở đieơn thê 100V trong 45 phút. Sau đieơn di gel được nhuoơm trong dung dịch ethidium bromide trong 10 phút, rửa lái baỉng nước roăi quan sát sạn phaơm khuêch đái tređn hoơp đèn soi UV có bước sóng 312nm.

- Dieên giại kêt quạ:

+ Nêu xuât hieơn vách tương đương với 299bp thì kêt luaơn là dương tính (+)

+ Nêu khođng xuât hieơn vách hoaịc vách có kích thước khođng phại 299bp kêt luaơn là ađm tính (-).

Thời gian cho toàn boơ qui trình khoạng 24 giờ (bao goăm khoạng 20 giờ taíng sinh và 4 giờ thực hieơn phạn ứng PCR) tính từ lúc nhaơn mău cho đên lúc trạ lời kêt quạ. Các bước cụa qui

Đoăng nhât

Ụ ở 370C trong 20 giờ

Lây 1ml cho vào eppendorf, li tađm 10.000 vòng/phút

Lối bỏ phaăn nước. Rửa sinh khôi tê bào với 1ml nước cât vođ trùng

Li tađm 10.000 vòng/phút , thu nhaơn sinh khôi

Huyeăn phù hóa sinh khôi vào 0,2 ml TE. Đun sođi cách thụy trong 10 phút

Li tađm 10000 vòng/phút, thu lây phaăn dịch phía tređn

Phạn ứng PCR trong 35 chu kỳ với các bước 95C trong 1 phút, 55C trong 45 giađy, 72C trong 1phút

Phađn tích kêt quạ tređn gel agarose 1,5%

Dieên giại kêt quạ

Hình 17. Tóm taĩt qui trình phát hieơn E. coli trong thực phaơm baỉng PCR