2 1 Thành phần hóa học của lá [9,14,16,18,19,0]
3.1. CƠ SỞ CỦA PHƯƠNG PHÁP CHIẾT
Phương pháp là phương pháp thu lấy một hay nhiều chất từ hỗn hợp ựã tách biệt, cô lập và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng. Quá trình chiết gồm một số giai ựoạn sau:
Giai ựoạn 1: Dung môi thắm ướt lên bề mặt nguyên liệu sau ựó thắm sâu vào bên trong tạo ra dung dịch chứa các hoạt chất. Sau ựó dung môi tiếp tục hòa tan các chất trên bề mặt bằng cách ựẩy các bọt khắ chiếm ựầy trong các khe vách trống.
Giai ựoạn 2: Giai ựoạn tiếp tục hòa tan các hoạt chất trong các ống mao dẫn của nguyên liêụ bị bọc kắn nhờ vào dung môi ựã thắm sâu vào các lớp bên trong. Ta có thể chiết chất rắn bằng chất lỏng hoặc chất lỏng bằng chất lỏng.
Chiết chất rắn bằng chất lỏng: Là làm tan hoạt chất có từ chất rắn sang chất lỏng (là dung môi). Có thể tăng tốc ựộ chuyển hướng bằng cách nghiền nguyên ựể tăng bề mặt tiếp xúc trước khi chiết khuấy. Thường chất rắn ựược chiết nóng liên tục với dung môi là chất bay hơi trên bộ chiết Soxhlet.
Chiết lỏng trong dung dịch (phần lớn là nước): Là lắc dung dịch với dung môi thắch hợp có khả năng hòa tan chất hữu cơ hơn là dung môi cũ. 3.2. YÊU CẦU CỦA DUNG MÔI KHI CHIẾT
Chất lượng của hợp chất thu ựược cùng với hiệu suất chiết và các ựiều kiện kỹ thuật khác phụ thuộc vào dung môi chiết. Bởi vậy dung môi dùng ựể chiết cần thỏa các ựiều kiện sau:
Có nhiệt ựộ sôi thấp. Tuy nhiên nếu thấp quá thì tổn thất dung môi sẽ lớn, trong sản xuất dễ gây hỏa hoạn khi thu hồi dung môi.
Không có tác dụng hóa học ựối với các chất có trong nguyên liệu và không bị thay ựổi tắnh chất khi sử dụng lại.
Ẩn nhiệt bốc hơi của dung môi phải thấp ựể khỏi tiêu hao nhiều nhiệt.
Có khả năng hòa tan lớn các hoạt chất nhưng rất bé ựối với tạp chất, ựặc biệt ựối với nước phải ắt hòa tan.
Không ựược tạo thành hỗn hợp nỗ với không khắ, không ựược có những tạp chất không bay hơi và khi bay hơi khong ựược ựể cặn có mùi lạ.
Phải tinh khiết, không ựược ăn mòn thiết bị. Không gây mùi lạ ựối với sản phẩm và không ựộc hại ựối vói người sử dụng.
Phải rẻ tiền và dễ mua.
3.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT
Phương pháp chiết xuất bao gồm cả việc chọn dung môi dụng cụ chiết và cách chiết.
Một phương pháp chiết xuất thắch hợp chỉ có thể hoạch ựịnh một khi ựã biết rỏ thành phần hóa học của cây. Một loại hợp chất có ựộ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi. Vì vậy không thể có một phương pháp chiết xuất chung áp dụng cho tất cả các hợp chất trong cây.
Lựa chọn phương pháp trắch ly ựể có ựược cao trắch thô là công việc rất quan trọng ựể tránh thủy phân hợp chất, tránh các phản ứng phụ, các phản ứng chuyển vị.
Trong cây thường chứa một số cấu tử dược xem như những chất gây cản trở trong quá trình chiết xuất hoặc tinh chế hợp chất như các diệp lục tố Polyphenol,Ầ đôi khi các chất dùng ựể bôi trơn dụng cụ thủy tinh: Vaselin, silicon cũng nhiễm vào dung dịch ly trắch.
Có nhiều cách sữ dụng dung môi ựể trắch ly mẫu cây. Khi cho dung môi chiết vào, dung môi sẽ thấm qua màng tế bào của cây, các hoạt chất trong tế bào sẽ hòa tan vào trong dung môi. Khi ựó xuất hiện một quá trình thẩm thấu giữa dung dịch chiết thành trong tế bào và dung môi bên ngoài. Quá trình thẩm thấu này kết thúc khi có sự cân bằng về nồng ựộ hợp chất của dung dịch bên trong và bên ngoài thành tế bào. Như vậy, ở sự chiết xảy ra hai quá trình:
Quá trình hòa tan. Quá trình thẩm thấu.
tiếp xúc với thành tế bào một cách dễ dàng, thúc ựẩy quá trình chiết xuất một cách nhanh chóng và nâng cao hiệu suất.
3.3.1. Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt (Percolation)
Phương pháp ngấm kiệt là một trong những phương trắch ly ựược sử dụng phổ biến nhất vì không ựòi hỏi nhiều thao tác cũng như thời gian.
Dụng cụ gồm một bình ngấm kiệt hình trụ ựứng, bằng thủy tinh, ở dưới ựáy bình là một van khóa có ựiều chỉnh vận tốc của dung môi chảy, khi ựã ngâm mẩu cây trong dung môi sau một thời gian nhất ựịnh.Dung môi chảy ra ựược hứng trong một erlen ựể bên dưới, trên cao có một bình lóng chứa dung môi ựể nhỏ vào bình khuấy ngấm kiệt này.
đây là quá trình chiết liên tục thay thế bằng dung môi mới. Tuy vậy mà người ta không thực hiện liên tục ma mẫu cây ựược ngâm liên tục trong dung môi khoảng 12 giờ, cho dung môi bão hòa chảy ra rồi thay thế bằng dung môi mới và tiếp tục quá trình trắch ly. để khảo sát sự chiết xuất ựã hoàn toàn chưa, người ta thường theo dõi bằng cách lấy dung dịch trắch ly thử với các thuốc thử ựặc trung của hoạt chất.
3.3.2. Chiết bằng phương pháp ngâm dầm(Maceration)
Phương pháp ngâm dầm không hiệu quả gì hơn so với phương pháp ngấm kiệt, chỉ là ngâm bột cây trong bình chứa thủy tinh hoặc thép không gỉ có nắp ựậy. Rót dung môi phủ lớp bột cây, ựể yên ở nhiệt ựộ phòng, dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu và hòa tan các chất tự nhiên trong cây. Có thể gia tăng hiệu quả chiết xuất bằng cách khuấy bột cây hoặc dùng máy lắc nhẹ. Sau 24 giờ, dung môi trong bình ựược ựổ ra và rót dung môi mới vào.
3..3.3. Chiết bằng phương pháp ngắm kiệt ngược dòng
đây là sự kết hợp giữa phương pháp ngấm kệt với phương pháp ngâm dầm. Bột cây ựược cho vào bình chiết khác nhau, vắ dụ có 3 bình A, B, C bột cây ựược cho vào cả ba bình. Cho dung môi vào bình A, ngâm và lấy ra dung dịch A1. Dung dịch này ựể riêng, cho dung môi mới vào bình A, dịch chiết lấy ra lần sau gọi là A2. Lấy dịch A2 dùng làm dung môi cho bình B. Dịch chiết B1 ựể riêng,
sau ựó cho dung môi mới vào bình B ựể có dịch B2, dịch chiết này ựược làm dung môi cho bình C. Như vậy, dung dịch chiết ra từ bình chiết trước ựược làm dung môi ựể ngâm bọt cây cho bình tiếp theo, cứ tiếp tục như vậy cho ựến các bình sau. đây là phương pháp ựược ứng dụng nhiều trong sản xuất lớn. Phương pháp này chỉ khác phương pháp ngấm kiệt là dịch chiết sau khi lấy ra không theo phương pháp nhỏ giọt mà mở khóa cho chảy thành dòng sau khi ngâm một thời gian nhất ựịnh.
3.3.4. Chiết bằng Soxhlet
Bộ dụng cụ Soxhlet ựược bán sẵn với nhiều loại kắch cỡ. Phương pháp này có ưu ựiểm là sử dụng một lượng ắt dung môi mà vẫn có thể chiết kiệt ựược hoạt chất. Sự chiết xuất tự ựộng, liên tục nên nhanh chóng.
Muốn biết việc chiết xuất ựã cạn kiệt chưa, tháo phần ống ngưng hơi, dùng pipette hút vài giọt dung môi ựang chứa trong bình chứa mẫu cây, nhỏ lên mặt kắnh hay giấy lọc, dung môi bay hơi sẽ ựể lại vết cặn. Nếu thấy không còn vết nữa nghĩa là việc chiết xuất ựã kiệt, nếu thấy có vết thì tiếp tục chiết thêm một thời gian nữa.
Nhược ựiểm của phương pháp này là không chiết xuất ựược một lượng lớn mẫu cây nên chỉ thắch hợp cho việc nghiên cứu trong phòng thắ nghiệm. Một bất tiện nữa trong suốt quá trình chiết xuất mẫu cây luôn luôn ở nhiệt ựộ sôi của dung môi nên những hợp chất kém bền nhiệt như Carotenoid có thể bị thủy giải, phân giải hoặc tạo các hợp chất Artefat.
3.3.5. Chiết bằng cách ựun hoàn lưu
Bột cây và dung môi ựược chứa trong mội bình cầu có gắn ống sinh hàn. đun hoàn lưu trên bếp cách thủy ở nhiệt ựộ sôi của dung môi, sau một thời gian cần thiết dung dịch cần chiết ựược lấy ra và lọc qua giấy lọc. Dung môi mới ựược cho vào và tiếp tục chiết từ 3 ựến 4 lần ựến khi kiệt.
Hiếm khi người ta ựun bột cây với dung môi là nước, dù rằng trắch ly với nước mà phương pháp mà dân gian sắc thuốc ựể uống và một số chất cũng tan ựược trong nước, người ta thường dùng hỗn hợp CH3OH Ờ H2O hoặc
3.3.6. Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước
đây là phương pháp ựặc biệt ựể ly trắch tinh dầu và nhưng hợp chất dễ bay hơi có trong cây. Dụng cụ gồm một bình cầu lớn ựể cung cấp hơi nước, hơi nước sẽ ựược dẫn sục vào bình chứa mẫu cây, hơi nước tiếp tục bay hơi và ngưng tụ bởi một ống sinh hàn, ta thu ựược hợp chất tinh dầu và nước.
Chương 4: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT [1]
4.1. SẮC KÝ CỘT [4]
Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hoặc chất làm nên cho pha cố ựịnh ựược nhồi trong các ống hình trụ gọi là ỘcộtỢ. Tùy theo tắnh chất của chất ựược sử dụng làm cột mà sự tách trong cột sẽ xẩy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế phân bố (cột phân bố), trao ựổi ion (cột trao ựổi ion),...Ở ựây chúng tối chỉ trình bày sắc ký cột hấp phụ.
4.1.1 Nguyên tắc
Sắc ký hấp phụ ựược tiến hành trên một cột thủy tinh thẳng ựứng gọi là ỘcôtỢ với chất hấp phụ ựóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột là pha ựộng chảy qua chất hấp phụ.
đối với mỗi chất chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó ựối với dung môi rửa cột ựể lấy ra ựược lần lượt trước hoặc sau.
Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng là oxyt nhôm, silica gel, CaCO3, than hoạt tắnh, polyamid,ẦCác chất này phải ựược tiêu chuẩn hóa như:
- Al2O3 trung tắnh (Merck), cỡ hạt 0.063 Ờ 0.200 mm (70 Ờ 200 mesh). độ hoạt hóa số I 0.50% H2O II 2.4% H2O III 4.3% H2O IV 6.6% H2O V 15% H2O - Al2O3 bazơ, cỡ hạt 0.0063 Ờ 0.200 mm (70 Ờ 200 mesh) độ hoạt hóa số I 1.2% H2O II 3.5% H2O III 5.8% H2O IV 8.1% H2O V 10% H2O
- Polyamid M Ờ K cỡ hạt < 0.07 mm.
Silica gel là pha tĩnh ựược sử dụng rộng rãi nhất ựể tách các hợp chất tự nhiên.
Dung môi dùng trong sắc ký cột có thể từng loại riêng biệt hoặc là hỗn hợp 2, 3 loại dung môi với tỷ lệ thắch hợp.
Với các chất hấp phụ cổ ựiển, dung môi sử dụng có ựộ phân cực tăng dần. Cột là những ống hình trụ bằng thủy tinh, ựầu dưới có khóa, ựầu trên có nút mài ựể nối với một phễu chứa dung môi, loại này thường bán sẵn trên thị trường với nhiều loại kắch cỡ lớn nhỏ. Hoặc cột cũng có thể tự lắp bằng một ống thủy tinh thường, ựầu dưới nhỏ nối với một ống cao su, dùng một khóa kim loại ựể ựiều chỉnh tốc ựộ chảy của dung môi.
Việc lựa chọn kắch thước cột rất quan trọng. Thông thường cột có ựường kắnh nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt. Một vài cột có kắch thước bán sẵn tương ứng với chiều dài và kắch thước cột:
đường kắnh (cm) Chiều dài (cm)
1 15
2 25
3 40
4 60
5
4.2. KỸ THUẬT TRIỂN KHAI
4.2.1. Chuẩn bị cột
- Rửa cột thât sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
- Cho bông gòn vào ựáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch). - Kẹp cột thẳng ựứng trên giá sắt
- Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán ựồng ựều ở mỗi ựiểm trong cột thành một khối ựồng nhất.
- Tỷ lệ =
- Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay ựổi thông thường từ 1/20, 1/30, 1/50, 1/100,Ầ
- Có hai cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô.
- Nhồi cột ướt: Dùng cho các chất hấp phụ có khả năng trương phình như silica gel, sephadex,Ầ thì phải ngâm trong dung môi một thời gian trước khi cho vào cột ựể tránh bị nứt cột. Lắc, trộn ựều bột hấp phụ với dung môi tạo thành một hỗn dịch, rót vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống ựáy cột. Hỗn dịch dung môi và chất hấp phụ không nên quá sệt khiến bọt khắ bị giữ trong cột và cũng không ựược quá lỏng ựể phải rót nhiều lần vào cột. Chú ý trong quá trình nhồi cột, dung môi vẫn liên tục chảy ựều ra cột hứng, và không ựược ựể khô dung môi trong cột. Sau khi nhồi cột hết chất hấp phụ vào cột dùng dung môi hứng ựược tiếp tục rót vào cột và cho chảy liên tục một thời gian ựể cột hấp phụ ựược hoàn toàn ổn toàn ổn ựịnh. Mặt thoáng trên ựầu cột phải nằm ngang, người ta cho thêm một lớp cát hoặc bông ựể không làm xáo trộn mặt gel.
- Nhồi cột khô: Dùng cho các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như Al2O3, CaCO3. Chất hấp phụ ựược nhồi từ từ vào cột ở dạng khô bởi một phễu có cuống dài. Dùng một que bằng gỗ hoặc cao su gõ nhẹ và ựều chung quanh cột theo chiều từ dưới lên ựể bột xuống ựều ựặn. Khi chất hấp phụ ựược cho hết vào cột mới rót dung môi vào và cho chảy liên tục một thời gian ựể cột ựược ổn ựịnh và từ lúc này trở ựi, không ựược ựể khô dung môi trong cột.
4.2.2. đưa chất phân tắch vào cột
Yêu cầu của việc ựưa chất phân tắch vào cột là phải phân tán chất thử thành một lớp mỏng ựồng ựều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều phương pháp ựưa chất phân tắch vào cột.
Phương pháp dùng ựĩa giấy:
Dùng giấy lọc cắt thành một ựĩa tròn có ựường kắnh nhỏ hơn ựường kắnh trong của cột khoảng 0.5 mm. Dùng kim châm thành những lỗ thủng cách ựều nhau. Chất cần phân tắch ựược hòa tan trong một lượng dung môi vừa ựủ, cho
Trọng lượng chất phân tắch Trọng lượng chất hấp phụ
sấy, rồi tiếp tục tẩm dung dịch thuốc thử. Nếu tiến hành với cột lớn, lượng chất thử nhiều, có thể dùng nhiều ựĩa giấy.
Sau khi cột ựã ựược ổn ựịnh với dung môi, mở vòi cho dung môi chảy cho ựến khi mức dung môi bằng với mặt ngang chất hấp phụ thì khóa vòi lại. đặt cấn thận các ựĩa giấy lên mặt cột, dùng ống hút cho dung môi tẩm ướt ựều giấy, cho một lớp cát mịn lên giấy và bắt ựầu cho dung môi chảy.
Cho thẳng dung dịch thử lên cột:
Hòa tan chất phân tắch vào một lượng vừa ựủ dung môi (càng ắt càng tốt nhưng phải bảo ựảm hòa tan hoàn toàn). Dung dịch thử có nồng ựộ càng ựậm ựặc mới nằm thành một lớp mỏng trên ựầu cột. Cột ựã ổn ựịnh, mở vòi cho dung môi chạy cho ựến khi mặt cột hấp phụ vừa khô thì ựóng lại. Dùng ống hút cho dung dịch thử chảy dọc thành cột. Mở khóa bên dưới cho dung dịch thử ngấm vào cột (không ựược ựể chất hấp phụ ở ựầu cột bị khô). Khi toàn bộ lớp dung dịch thử ựã ngấm hết vào cột, dùng ống hút lấy một ắt dung môi rửa thành cột và cũng cho ngấm hết vào cột. Tiếp tục cho dung môi ựể bắt ựầu quá trình giải ly.
Trộn chất thử với một lượng chất hấp phụ:
Trộn dung dịch chất phân tắch với một lượng nhỏ chất hấp phụ cho thật ựều, sấy khô rồi cho vào cột bằng cách rải thành một lớp ựều ựặn trên mặt cột.
Trong ba cách trên, cách cho thẳng dung dịch vào cột là gọn và nhanh hơn cả, nhưng phải bảo ựảm các yêu cầu kỹ thuật sau:
- Chất thử hòa tan hoàn toàn.
- Dung dịch chất thử phải nạp vào cột ựều.
- Khi toàn bộ chất thử ngấm hết vào cột, mới cho tiếp dung môi mới. - Cho dung môi nhẹ nhàng, không làm xáo ựộng mặt cột. Nếu chất thử ngấm vào cột tạo thành những lớp có bề dày ựều nhau là chứng tỏ kỹ thuật ựảm bảo.
4.2.3. Rửa cột - còn ựược gọi là giải ly chất ra khỏi cột