D A= K.C (6.7) Hay nói cách khác, sự phụ thuộc giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch là
9.6.PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ 1 Nguyên tắc
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ
9.6.PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ 1 Nguyên tắc
9.6..1 Nguyên tắc
Sắc ký khí là quá trình tách các chất trong cột tách ở trạng thái khí, chất mang mẫu là chất khí. Vì thế chỉ có thể để tách được hỗn hợp các chất khí hay các chất lỏng hoặc chất rắn có thể dễ dàng hóa khí ở dưới 2500C, khi bơm mẫu vào cột
ở dạng lỏng. Nếu là chất rắn thì phải hòa tan trước trong một dung môi phù hợp tạo ra dung dịch mẫu rồi mới bơm vào cột sắc ký để hóa khí chúng. Với các chất ở nhiệt độ hóa hơi cao hơn 2500C, phải hóa hơi trước trong buồng hóa hơi riêng có nhiệt độ cao ở đầu cột sắc ký, sau đó mới dẫn vào cột tách. Tất nhiên, với các chất loại này, việc sắc ký là rất phức tạp và khó khăn.
Trong sắc ký khí, pha tĩnh cũng là chất rắn. Nó được nhồi đầy vào cột tách (cột thường), hoặc chỉ là một lớp mỏng bám vào thành trong của cột sắc ký (sắc ký mao quản). Còn pha động là một chất khí, hay một hỗn hợp hai chất khí. Chất khí này mang mẫu vào cột để thực hiện quá trình tách. Nó chuyển động (hay dẫn vào) liên tục trong suất quá trình tách với một tốc độ xác định.
Với sắc ký khí, việc thực hiên quá trình sắc ký có thể theo hai kĩ thuật: Giữ nhiệt độ hằng số trong suốt quá trình tách.
Thực hiện gradient nhiệt độ trong quá trình tách.
Khi tách một hỗn hợp phức tạp chứa nhiều chất có nhiệt độ sôi khác nhau lớn, như các hợp chất tự nhiên, các dược phẩm, …Qúa trình gradient nhiệt độ là rất cấn thiết vì quá trình này tạo điều kiện để các chất tách ra khỏi nhau.
9.6.2. Máy sắc ký khí
Máy sắc ký khí là một hệ thống trang bị để thực hiện quá trình sắc ký. Nó bao gồm 6 phần cơ bản:
9.6.2.1. Hệ thống cung cấp khí cho quá trình sắc ký, gồm các regulator, flow meter, gas valves. Hệ thống này phải cấp được dòng khí ổn định cần thiết theo yêu cầu của quy trình phân tích sắc ký.
9.6.2.2 Bộ xylanh bơm mẫu vào cột (sample Valve), có thể bơm được một lượng mẫu chính xác vào cột trong vùng thể tích từ 5-100 µl, và lặp lại được tốt.
9.6.2.3. Cột tách sắc ký. Đây là phần quan trọng nhất, nó quyết định hết quả của sự tách một hỗn hợp tốt hay xấu. Đó là pha tĩnh, chất nhồi cột (packing materials). Tất nhiên, đối với mỗi loại sắc ký, chất nhồi khác nhau về bản chất. Cột sắc ký làm bằng thép, hợp kim đồng, có chiều dài từ 3-5m, đường kính 2,5-4 mm. Cột mao quản làm bằng thủy tinh, chiều dài từ 15-100m, đường kính 0,25-1 mm.
9.6.2.4. Hệ lò nung cột tách và hệ điện tử điều khiển lò nung: có nhiệm vụ làm nóng cột hoặc theo chế độ nhiệt độ không đổi hay chế độ gradient nhiệt độ của sự tách sắc ký yêu cầu.
9.6.2.5. Detector: là nộ phận để phát hiện, nhận biết các chất phân tích dựa theo nhứng tính chất vật lý hóa học nào đó, và ứng với mỗi một tính chất của sự phát hiện, người ta có một loại detector nhất định, ví dụ:
- Detector ion hóa ngọn lửa (Flame ionization detector: FIA) - Detector bắt điện tử (Electron capture detector: ECD) - Detector độ dẫn (Conductivity detector: CD)
- Detector dẫn nhiệt (Thermal conductivity detector: TCD) - Detector phát xạ nguyên tử (Atomic emission detector: AED)
- Trong các loại detector này, loại 1 và 2 được sử dụng phổ biến hơn (bảng 9.5.). Nhưng bất kỳ loại nào cũng phải thỏa mãn những yêu cầu đã nêu trong mục 9.4 ở trên mới có thể dùng được.
9.6.2.6. Bộ phận ghi và chỉ thị kết quả tách sau detector. Nó có thể là một trong các bộ phận sau:
- Bộ tích phân kế (Intergrator) - Máy tự ghi (Strip-chart-recorder) - Hay computer with printer
- Đó là 6 phần cơ bản cần thiết nhất. Tất nhiên hiện nay có hệ thống máy sắc ký hoàn chỉnh thường có gắn theo máy tính, bộ phận tự động bơm mẫu, bộ phận xử lý kết quả theo chương trình đặt ra, chương trình hóa quá trình sắc ký, …Toàn bộ hệ thống máy sắc ký ta có thể minh họa như trong hình 9.10.
Bảng 9.5. Các loại detecter trong GC
Loại Ứng dụng Độ nhạy (g) T.tính Noise Khí mang FIA phổ biến 10-13 107 nhỏ H2, Air ECD phổ biến
chọn lọc
10-13 107 nhỏ N2, H2
CD Ít 10-10 105 nhỏ N2, Air TCD nhiều 10-8 105 vừa H2, He AED Ít (mới) 10-10 105 lớn, vừa He, Air, N2 TID Ít (mới) 10-8 105 nhỏ, vừa N2
Hình 9.10. Sơ đồ khối của thiết bị sắc ký khí
9.6..3. Pha tĩnh trong sắc ký khí
Pha tĩnh trong sắc ký khí có thể được chế tạo và sử dụng ở 2 trạng thái rắn và lỏng. Do đó có tên: Gas- Liquid Chr (GLC) và Gas- Solid Chr (GSC). Nếu ở trạng thái lỏng để giữ nó trong cột tách, thì phải tẩm nó trên chất mang trơ rắn. Do đó pha tĩnh chỉ là một lớp màng mỏng xung quanh hạt chất mang trơ. Chất mang trơ là các oxit silica đã hoạt hoá cho trơ và chế tạo thành những hạt hình cầu kích thước Φ = 3÷5µm. Pha tĩnh lỏng thường là các dầu silicon hay các polyeter. Do có cấu tạo như thế nên pha tĩnh loại này có dung tích hấp phụ nhỏ. Mặt khác lại là màng chất lỏng, nên sự tách thường chỉ được dùng ở nhiệt độ thấp. vì thế nó ít được sử dụng hơn pha tĩnh rắn
Pha tĩnh rắn là được chế tạo ở dạng các hạt hình cầu hay mảnh nhỏ có Φ= 3÷7 hay 10µm, trên ba loại nền là silica, oxit nhôm, và cao phân tử hữu cơ (polystyrene). Nhưng phổ biến nhất là nền silica, và ứng dụng với loại sắc ký cũng có một loại pha tĩnh riêng, ví dụ pha tĩnh của:
- Sắc ký hấp thụ pha thường - Sắc ký hấp thụ pha ngược - Sắc ký trao đổi ion
- Sắc ký rây (sàng) phân tử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
được sử dụng nhiều.
Chất nhồi pha thường của sắc ký khí là các silica trung tính được chế tạo trong điều kiện đặc biệt, có dung lượng hấp phụ cao, diện tích bề mặt riêng lớn, độ xốp cao (bảng 9.6). Gần 80% số chất nhồi loại này của các hãng đều sản xuất trên nền silica. Nền thứ hai là nhôm oxit
Pha tĩnh của loại hấp thụ pha thường là rất kỵ nước. Nó có bề mặt ưa nước và nước làm mất tính chất sắc ký của bề mặt hấp thụ, qua việc hình thành các cầu hydro của nhóm OH trên bề mặt pha tĩnh với các phân tử nước
Chất nhồi cột pha ngược là các silica trung tính đã được ankyl hoa, các nhóm OH trên bề mặt đã bị thay bằng các nhóm ankyl, ví dụ: -CH3, - C2H5, - C3H7, - C18H17, - C18H37, phenyl,…Do đó tính ưa nước không còn nữa. Nên bề mặt sắc ký không còn bị ảnh hưởng bởi độ ẩm nữa. Trong thực tế loại pha ngược được sử dụng phổ biến hơn. Nó thích hợp cho việc tách nhiều loại hợp chất, từ không phân cực đến phân cực (bảng 9.7)
Bảng 9.6. Pha tĩnh của GLC
Tên Ký hiệu Tmax (C) Để tách
Polydimethyl siloxane OV-1; SE-30 350 Hydrocacbon, aromatic, drugs, steroides
Poly-(phenyl methyl)- siloxane (10% phenyl)
OV-3; SE-52 350 Axit béo, ester, alkaloides halogen compounds, drugs Polyethylene glycol Carbowax20M 250 Axit tự do, alkohols,
ethers, oils, glycols Pha tĩnh được nạp vào trong cột tách có thể theo hai cách:
- Nhồi đầy cột bằng kỹ thuật rung, cách này cho các cột tách kích thước bình thường (Φ= 2-4mm) và cột thép hay cột đồng
- Tẩm thành một lớp bề mặt trong của cột, cách này thường dùng cho các loại cột mao quản bằng thuỷ tinh, đường kính nhỏ hơn 1mm
Bảng 9.7.. Ví dụ về pha tĩnh rắn (GSC) Nền (Matrix) Carbowax Chromsorb W Chromsorb G Anachrom Chromsorb N-AW Celite 545 Chromsorb W-AWDMCS Silica Silica Silica Silica Silica Silica Silica
9.6.4. Pha động trong sắc ký khí
Pha động trong sắc ký khí thường là các chất khí đơn hay hỗn hợp của hai khí. Nó có nhiệm vụ:
- Rửa giãi chất phân tích ra khỏi cột - Mang chất phân tích ra khỏi cột
Vì thế nhiều người quen gọi là khí mang của GC. Việc chọn chất khí nào làm khí mang là tuỳ thuộc vào:
- Bản chất của chất phân tích
- Loại detector chọn để phát hiện chất phân tích - Kỹ thuật sắc ký (T= const hay građient T)
Các chất khí thường được dùng là hydro, nitơ, heli, argon tinh khiết phải đạt > 99,9%
Trong quá trình sắc ký, tốc độ chảy của pha động có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả tách một hỗn hợp. Nói chung, tốc độ khí thường được sử dụng trong vòng từ 100-250 ml/phut cho nhiều đối tượng mẫu.
9.6..5. Sự lưu giữ của chất
Sự lưu giữ của các chất trong cột tách cũng được quyết định bởi các yếu tố như:
- Các đặc trưng của pha tĩnh
- Bản chất của pha động, thành phần và tốc độ của pha động
- Nhiệt độ của quá trình tách. Trong GC yếu tố này cực kỳ quan trọng. Do đó trong nhiều trường hợp người ta phải thực hiện chế độ građient nhiệt độ để thu được kết kết quả tách tốt.
9.6.6. Tối ưu hoá các điều kiện sắc ký
Tối ưu hoá các điều kiện sắc ký là quá trình nghiên cứu tìm những điều kiện tách phù hợp nhất cho một hỗn hợp hay một loại hỗn hợp chất cần phân tích. Công việc này chính là xây dựng một quy trình phân tích. Nó bao gồm các vấn đề sau dựa theo chất mẫu phân tích:
1. Chọn loại cột sắc ký: Kích thước, loại pha tĩnh, cột sắc ký thường hay cột mao quản
2. Chọn pha động là chất nào, thành phần và tốc độ của nó (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Chọn kỹ thuật sắc ký ở nhiệt độ không đổi, hay gradient nhiệt độ liên tục, gradient nhiệt độ từng bậc, từng đoạn cần thiết,.v.v…
4. Chọn máy GC với detector phù hợp để phát hiện các chất phân tích với độ nhạy cao
5. Chọn cách xử lý mẫu và lượng mẫu bơm vào cột tách. Ở đây rất quan trọng là dung môi hoà tan mẫu mà không gây ảnh hưởng đến kết quả tách
6. Chọn điều kiện thu ghi sắc đồ của quá trình tách sắc ký của hỗn hợp mẫu Thực hiện hoàn chỉnh 6 công việc này ta sẽ chọn được điều kiện phù hợp cho việc phân tích định lượng một hỗn hợp mẫu đạt kết quả tốt. Nếu làm tất cả những việc trên, mà chất nền (matrix) của mẫu vẫn ảnh hưởng đến quá trình tách, sắc đồ chưa tốt, thì ta phải tìm cách loại bề mặt chất nền của mẫu.
9.6.7. Phân tích định tính
Nguyên tắc của phát hiện định tính là dựa vào thời gian lưu (tRi) của các chất trong một điều kiện sắc ký nhất định đã chọn. Vì như ta đã biết, thời gian lưu tRi là đặc trưng cho mỗi chất. Do đó để định tính một hỗn hợp các chất ta phải:
- Chạy sắc ký của một hỗn hợp các chất chuẩn để xác định thời gian lưu tRi của các chất đó
- Chạy sắc ký của hỗn hợp mẫu phân tích
Sau đó so sánh thời gian lưu tRi của các chất trên hai sắc đồ, ta sẽ suy ra trong mẫu phân tích có chứa những chất nào. Như ví dụ trong hình 8.5 ta thấy mẫu sắc đồ chuẩn có các chất X1, X2, X3, X4, X5, còn trong mẫu phân tích chỉ có chất X2, các chất khác không có.
Hiện nay với hệ thống máy GC hiện đại,có gắn máy tính và chương trình xử lí số liệu, thì computer đã nhớ sẵn thời gian lưu tRi của chất phân tích, nó sẽ so sánh và thông báo kết quả ngay sau khi chạy sắc lý mẫu phân tích.
9.6.8. Phân tích định lượng.
Trong quá trình sắc kí, tín hiệu đo được của quá trình sắc ký hoặc là chiều cao của pic hoặc là diện tích của pic sắc ký. Trong những điều kiện sắc kí xác định, thì 2 đại lượng này luôn có quan hệ phụ thuộc vào nồng độ của chất ở trong mẫu. Mối quan hệ này có thể được biểu thị bằng 2 phương trình sau đây:
Theo chiều cao H: H = k.c Hay là theo diện tích S: S = k.c
Ở đây : H và S là chiều cao và diện tích của pic sắc ký; C là nồng độ của chất trong mẫu; còn k là hằng số, nó được xác định bởi các đìêu kiện sắc ký đã chọn và bản chất của chất phân tích. Đây là 2 phương trình để định lượng trong GC. Trong 2
phương trình này, nếu đo H thì phạm vi tuyến tính hẹp với nồng độ C; còn nếu đo S thì quan hệ tuyến tính giữa S và C lớn hơn. Do đó, trong thực tế của phân tích GC người ta hay sử dụng phương trình : S = k.c để định lượng.
9.6.8.1. Phân tích bán định lượng.
Ở đây để định lượng, người ta coi tổng diện tích của tất cả các pic sắc ký của các chất trong mẫu phân tích là bằng 100%; Nghĩa là có:
St = (S1 + S2 + S3 + … + Si ) = 100 Do đó % của một chất Ci: = ×100 St Si Ci %
Tất nhiên, ở đây việc coi tổng St = 100 % chỉ là gần đúng. Vì độ nhạy của detector với mỗi chất phân tích là khác nhau. Nên cách này chỉ là bán định lượng mà thôi
9.6.8.2.. Phân tích định lượng
Cũng từ 2 phương trình cơ sở trên H=KC và S=KC, muốn định lượng chính xác một chất ta phải dùng phương pháp đường chuẩn. Cách làm cũng tương tự như mọi kỹ thuật phân tích định lượng khác sắc ký lỏng đã nói ở trên. Cụ thể là:
1.Trước hết chuẩn bị 1 dãy mẫu chuẩn của chất phân tích nồng độ Co, C1, C2, C3, C4, C5 trong cùng các điều kiện với các mẫu phân tích Cx (bảng 9.8 )
2. Chọn các điều kiện ghi sắc đồ của các mẫu chuẩn và mẫu phân tích, ta sẽ có được các cặp giá trị tương ứng giữa S và C hay H và C như trong bảng 9.8
3. Dựng đường chuẩn và xác định giá trị Cx cần tìm (hình 9.11)
Bảng 9.8. Các điều kiện dựng đường chuẩn.
Nồng độ C0 C1 C2 C3 C4 C5 Cx Giá trị đo S So S1 S2 S3 S4 S5 Sx,… Giá trị đo H Ho H1 H2 H3 H4 H5 Hx,…
Nếu mẫu phân tích có thành phần phức tạp chúng ta không thể pha được dãy mẫu chuẩn, thì phải dùng phương pháp thêm tiêu chuẩn là tốt nhất. Vì với kỹ thuật này chúng ta loại trừ được ảnh hưởng của thành phần nền (matrix) của mẫu .
H1H3 H3 H4 H5 C1 C2 C3 Cx C4 C5 H2 Hx C H (a) ` C C C1 3 C4 Cx C2 (b)
Hình 9.11.Đường chuẩn phân tích
a. Phương pháp đường chuẩn . b. Phương pháp thêm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
9.6.9. Vài ứng dụng của sắc ký khí.
Hiện nay sắc ký khí cũng là một kỹ thuật phân tích được sử dụng nhiều để phân tích các chất hữu cơ trong các lĩnh vực của , hoá dầu, hoá dược phẩm, hoá chất tự nhiên , hỗn hợp các hyđrocacbon các loại …