Khảo sát sự đường hóa tinh bột của nấm mốc
Nấm mốc được rắc lên cơm gạo nếp để nguội trên đĩa, ủ ở 30oC trong 48 giờ, sau đó bổ sung dung dịch idod 0.25%. Kết quả như sau:
Bảng 3.1 Khả năng phân cắt tinh bột của một số loài nấm mốc [15]
Nhóm Số lượng (loài) Đường kính vòng trong (cm)
Nhóm 1 8 7.1-9.0
Nhóm 2 21 5.0-9.3
Nhóm 3 24 2.1-4.7
Khảo sát quá trình lên men rượu và đánh giá mức độ lên men
Sau 4 ngày lên men, nhóm 3 thể hiện khả năng lên men rượu cao hơn 2 nhóm còn lại, nồng độ rượu 8.2-8.8 %w/v, lượng glucose thừa là 0, pH = 3.7-3.9, mùi vị cồn mạnh, mùi trái cây nhẹ. 5 dòng lựa chọn ngẫu nhiên từ nhóm 3 đều là
Saccharomyces cerevisiae (số 2.1, 15.7, 20.4, 23.9, 29.2) cho thấy dòng này lên men rượu tốt. Khả năng lên men của một số loài nấm men được cho trong bảng 3.2.
Khảo sát dòng S. cerevisiae No 2.1
- Khí tăng mạnh sau 24 giờ lên men và sau 60 giờ lên men, khí giảm mạnh. - Glucose giảm dần tỉ lệ nghịch với sự tăng nồng độ rượu.
Hình 3.1 Đồ thị sự chuyển hóa glucose, ethanol và khí sinh ra bởi S. cerevisiae No 2.1 ở 30oC [15]
Khảo sát sự tích tụ ethanol trong điều kiện lên men theo mẻ
Nồng độ ethanol và cơ chất (đường) tương tác lẫn nhau quyết định khả năng ức chế của ethanol lên nấm men. Nồng độ rượu tăng, khả năng sống và lên men của nấm men giảm vì những yếu tố khác nhau làm gia tăng nồng độ rượu bên trong tế bào gây độc cho chính tế bào. Lên men fed-batch giúp duy trì sự sống tế bào, lên men rượu hiệu suất cao và giữ áp suất thẩm thấu càng thấp càng tốt.
Glucose bổ sung vào các ngày 2, 4, 6, 9 và 11, tất cả 5 lần. Quan sát biểu hiện của 5 dòng gần giống nhau.
Sau ngày 11, thêm glucose không làm mới hoạt động lên men lên men nữa nên t (giờ) G lu co se v à et ha no l K hí
người ta ngừng thêm glucose sau ngày 11. Quan sát sự thay đổi lượng khí sinh ra cho đến ngày 15.
Lần cuối là sau 11 ngày lên men, quan sát không thấy có sự sinh khí nữa thì cá nhà khoa học giả thiết rằng lúc này mức độ lên men rượu phụ thuộc vào yếu tố khác, như là nồng độ rượu tích lũy cao.
Làm thí nghiệm với 50ml dịch đường 20oBrix chứa 10.5g glucose ban đầu. Mẫu lấy ngày 0, 4, 6, 9, 11, 14, 19, 24 và 29. Ngừng thêm glucose, vẫn phân tích lượng ethanol và glucose cho đủ 1 tháng thì thấy 5 dòng biểu hiện giống nhau.
Hình 3.2 Đồ thị tỉ lệ sinh khí của 5 giống nấm men S.cerevisiae (No 2.1, 15.7, 20.4, 29.2) trong lên men fed-batch [15]
Hiệu suất tạo ethanol (ethanol yield-EY): khả năng tiêu thụ glucose tạo ra rượu, được tính: EY t (ngày)
K
= (mol ethanol tạo ra/ mol glucose tiêu thụ) x 50%
Theo phương trình phản ứng: C6H12O6( 2C2H5OH + 2CO2. Hiệu suất tạo ethanol cao trong 11 ngày đầu làm nồng độ rượu trong môi trường tăng. Sau 14 ngày so sánh với 11 ngày, lượng glucose tiêu thụ tăng, nồng độ rượu không đổi. Sau 19 ngày, nồng độ rượu tăng và giữ cho đến cuối TN. Ethanol yield (EY) thay đổi từ 84-98% .
Lần thêm glucose cuối cùng không ảnh hưởng đến quá trình lên men ngay mà sau đó 1 tuần, thời gian cần thiết để phục hồi khả năng lên men. EY giảm nhẹ từ đó cho đến cuối TN.
Bổ sung glucose: 5ml/lần x 5, thể tích tăng từ 50ml lên 75ml. Lượng ethanol max = 10.1g (13.4% w/v), glucose còn lại ít (=2.3g) nên các nhà khoa học dự tính 13.4% w/v là khả năng chịu ethanol trong điều kiện lên men này.
Hình 3.3 Đồ thị hiệu suất tạo ethanol của 5 giống nấm men S.cerevisiae (No
H iệ u s u ất t ạo e th an ol ( % )
2.1, 15.7, 20.4, 29.2) trong lên men fed-batch [15] Thử khả năng chịu ethanol
Xác định số tế bào sống ban đầu và sau 3 ngày lên men ở 30oC bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, log cfu/mL.
So sánh với mội trường nuôi cấy bình thường , ta thấy : - Ở 0% hoặc 5% ethanol: lượng tế bào sống cao hơn. - Ở 10%-20%: lượng tế bào sống giảm.
( khả năng chịu ethanol 9-10%.
Hình 3.4 Đồ thị phát triển và suy vong của 5 giống nấm men S.cerevisiae (No 2.1, 15.7, 20.4, 29.2) theo nồng độ rượu khác nhau [15]
Kết quả này thấp hơn môi trường lên men fed-batch, do khác nhau về sự thay đổi dần dần (fed-batch) và thay đổi tức thời trong thí nghiệm này. Môi trường fed-batch tạo điều kiện huấn luyện thích nghi cho giống vi sinh vật tốt hơn.
M ật đ ộ tế b ào n ấm m en ( cf u .m l -1 )
Tác động của mật độ nuôi cấy và điều kiện ủ lên sự tạo ethanol của S. cerevisiae
Thí nghiệm được thực hiện trên loài 2.1. Ở 30oC, lên men 4 ngày, lượng glucose được tiêu thụ nhiều nhất, nồng độ rượu sinh ra cao nhất, pH = 3.7-3.9 không do sự tạp nhiễm mà do sự hình thành một số acid đồng thời với quá trình chuyển hóa tạo rượu. Nếu tăng mật độ cấy, sự lên men diễn ra nhanh hơn.
Ở 20oC và 40oC, sự lên men chậm hơn thông qua lượng glucose tiêu thu và lượng rượu tạo ra. Ở 20oC, tăng mật độ cấy, tăng tiêu thụ glucose còn 40oC thì ngược lại sự phụ thuộc của tốc độ tăng trưởng vào nhiệt độ và chịu stress bởi ethanol khác nhau ở những nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ tối thích.
Điều kiện tối ưu cho quá trình lên men rượu là: Topt = 28.3oC, thời gian 4 ngày, mật độ cấy 5.5 log cfu/ml, nồng độ rượu 9%. Sự thống kê tác động của nhiệt độ và thời gian lên quá trình tạo rượu đạt độ tin cậy là 95% nên chấp nhận kết quả.
Như vậy, năm dòng Saccharomyces cerevisiae tạo nồng độ rượu cao nhất được chọn. Cho lên men ở nồng độ glucose ban đầu 20% tạo ra 8.8% ethanol. Chúng có khả năng chịu nồng độ rượu cao 9-10% trong điều kiện bình thường và 13.4% (w/v) trong điều kiện lên men fed-batch. Quá trình lên men rượu diễn ra ở 28.3oC trong 4 ngày, dịch đường hóa của gạo được ủ với mật độ tế bào là 5.5 log cfu/ml [15].