- Nuôi cấy vi khuẩn ở 370C, 24 giờ.
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Kết quả phân lập:
4.6. Kết quả nhuộm bào tử
Sự hình thành bào tử là hình thức đổi mới tế bào khi vi khuẩn sống trong môi trường bất lợi không phù hợp cho việc sinh trưởng , phát triển bình thường của chúng. Ở vi khuẩn lactic, chúng không có khả năng này nên đay cũng trở thành đặc điểm nhận dạng của chúng.
Sau khi nhuộm bào tử vi khuẩn bằng phương pháp Schaeffer-Fulton, dùng vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy ở 2 tuần làm đối chứng, quan sát dưới kính hiển vi x 100 thấy được các chấm nhỏ li ti màu lục rất mờ nằm rãi rác.
Nhuộm bào tử, ngoài việc xác định những chủng có khả năng là vi khuẩn lactic, ta còn loại bỏ được các mầm bệnh có khả năng sinh bào tử ví dụ như Clostridium spp gây bệnh viêm ruột, là vi khuẩn hình que, gram dương và có khả năng sinh bào tử. Từ 22 chủng đã qua kiểm tra không có khả năng di động, tôi tiến hành nhuộm bào tử
4.7. Nhuộm kháng acid
Vi khuẩn lactic tuy là những vi khuẩn sinh acid nhưng chúng không có khả năng kháng acid mà chúng chi sinh trưởng tốt ở pH 4-6.5 vì vậy trong quá trình sinh trưởng phát triển, đến một giai đoạn nào đó, lượng acid sinh ra quá nhiều sẽ ức chế ngược lại sự phát triển của chúng. Dựa vào đặc tính này mà khóa phân loại của Bergey đã sử dụng làm một trong các yếu tố đặc trưng giúp định danh vi khuẩn lactic. Ngoài ra ở giai đocnj này ta loại bỏ một số vi khuẩn có tính kháng acif gây bệnh như Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae là những vi khuẩn gây bệnh lao. Chúng là những vi khuẩn gram dương, hình que và không sinh bào tử. Vì vậy nếu chúng có lẫn vào thì các phản ứng trước đó sẽ không nhận ra được.
- Từ 22 chủng cho kết quả không sinh bào tử, tiến hành nhuộm kháng acid, thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.3.
- Kết quả: tất cả điều bắt màu xanh.
- Kết luận 22 chủng vi khuẩn đều không có tính kháng acid.
Hình 4.12: Vi khuẩn Bacillus
subtilis sinh bào tử [65]
Hình 4.13: vi khuẩn không sinh bào tử
Qua các thử nghiệm trên và dựa vào khóa phân loại của Bergey ta đã xác định được 22 chủng thuộc giống Lactobacillus,. Ở vi khuẩn Lactobacillus mỗi loài sẽ có khả năng sử dụng các loại đường khác nhau nhằm tiến hành đi xâu hơn trong việc phân loại, ta tiến hành thử nghiệm khả năng lên men đường của các chủng.
Sau thử nghiệm catalase, tôi tiến hành thử khả năng sinh acid, nhuộm gram để chọn các vi khuẩn gram dương, thử nghiện di động, nhuộm bào tử, xét nghiệm oxidase và nhuộm kháng acid. Đến đây tôi đã loại bỏ dần để kết quả thu nhận cuối cùng là chọn được 20 chủng vi khuẩn Lactobacillus và 2 chủng lactococcus.
* Kết quả được thể hiện ở bảng 4.3
Từ việc xuất hiện 11 chủng không được lựa chọn qua các kiểm tra nhưng vẫn hiện diện trên môi trường phân lập là do nhiều yếu tố chẳng hạn như sự xuất hiện của vi khuẩn hiếu khí như đã thảo luận ở trên, thứ hai là có thể các chủng này không hiện diện trong các mẫu phân lập mà do các yếu tố ngoại cảnh như điều kiện nghiên cứu, phương pháp lựa chọn và khả năng kinh nghiệm. Thứ ba, với cùng một giao thức được áp dụng cho tất cả các mẫu vì tôi không thể đáp ứng được điều kiện cụ thể của từng chủng vi khuẩn lactic mà tôi mong muốn chọn ra từ mẫu của mình. Trong khi mỗi mẫu sản phẩm lên men tự nhiên chắc chắn chứa ít nhất 50 loài vi khuẩn khác
Hình 4.15: Vi khuẩn bắt màu không có tính kháng acid. Hình 4.14: Vi khuẩn
Mycobacterium smegmatis có
một số loài khác (Boskey et al, 2000), các nghiên cứu khác cũng tìm thấy được không chỉ vi khuẩn lactic hiện diện trong các nguồn. Ví dụ, Chapman và Sharpe (1981) [15] được tìm thấy Streptococcus trong phô mai, trong khi đó lại Savadago et al (2004) cũng phân lập Streptococcus Lactococcus từ sữa. Shaw & Harding (1984) nói đến sự hiện diện của Carnobacterium trong các sản phẩm thịt, cá lên men. Rất nhiều giống không chỉ vi khuẩn lactic có thể được tìm thấy ở môi trường sống của vi khuẩn lactic. Vì vậy chúng có chung một số đặc điểm sinh hóa và trao đổi chất. Khi lập ra sơ đồ phân lập tôi đã xác định nếu phân lập thành công vi khuẩn lactic thì bằng những phương pháp kiểm tra đã đề ra tôi chỉ có thể thu hẹp khả năng xác định đến cấp giống bằng cách so sánh các kết quả thu được với khóa phân loại của Bergey và những tiêu chuẩn của Sharpe. Tuy nhiên tôi vẫn muốn đi sâu hơn trong kết quả nghiên cứu vưới mong muốn thu hẹp đến việt xác định đến cấp loài. Tôi tiến hành các kiểm tra khả năng lên men đường với nhiều loại đường khác nhau. Tuy hiên với khả năng cho phép của phòng thí nghiệm. tôi chỉ dừng lại ở việc kiểm tra trên 5 loại đường nên tôi có thể khoanh vùng một số loài cho những chủng mà tôi phân lập được.