(5) Lúa nấu chín
(6) Gạo nấu chín
Ngoài ra, các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Tú (1997) còn thử nghiệm trên 3 loại môi trường khác để nhân sinh khối Trichoderma đó là:
(1) Môi trường gồm các thành phần là cám, trấu. (2) Môi trường than, bùn.
(3) Môi trường bột thạch cao tẩm mật rỉ 10%.
Thí nghiệm được tiến hành trong cùng điều kiện về ẩm độ, nhiêt độ và thời gian nuôi cấy và 2 dòng Trichoderma được chọn là Trichoderma 1 và Trichoderma 2. Kết quả của thí nghiệm như sau:
Môi trường cám trấu cho sản phẩm Trichoderma có lượng bảo tử trong chế phẩm khô đạt 109 bào tử/gram, số lượng bào tử cao nhất ở nhiệt độ phòng.
Môi trường than bùn và bột thạch cao tẩm mật rỉ cho số lượng bào tử/gram chế phẩm khô thấp hơn, khoảng 107 – 108
bào tử/gram.
Tiếp tục thực nghiệm thời gian bảo quản của chế phẩm Trichoderma 1 và
Trichoderma 2 đã lên men từ môi trường cám trấu sau 3 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng (29 – 32oC), tác giả Nguyễn Ngọc Tú (1997) cho biết số lượng số lượng bào tử tính được/ gram chất khô như sau: Trichoderma 2 còn 2,72.109 bào tử/gram so với ban đầu là 5,88.109 bào tử/gram và Trichoderma 1 còn 0,65.109 tế bào/gram so với ban đầu là 2,24.109
bào tử/gram.
1.4.2. Phƣơng pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm
Phương pháp lên men bề mặt không vô trùng tạo chế phẩm nấm đã được thực hiện bởi Evlacchova (1968). Môi trường dinh dưỡng được nấu sôi ở 1000C, và khi nguội cho thêm chất kháng sinh Streptomycine (0,01%) để ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men.
Tuy nhiên, để thực hiện phương pháp này có hiệu quả cần thực hiện 5 nguyên tắc chủ yếu sau:
(1) Bào tử nấm được cấy phủ kín khắp bề mặt môi trường dịch (đã đun sôi ở 1000C/20 phút). Các bào tử nấm sau khi cấy vào môi trường chúng phát triển nhanh
- 28 -
thành một màng mỏng khắp bề mặt môi trường, ngăn ngừa được khả năng nhiễm các vi sinh vật lạ.
(2) Lượng bào tử trên một đơn vị bề mặt môi trường được cấy với một lượng lớn đủ áp đảo được phát triển ban đầu của vi sinh vật lạ (1 – 2 tỷ bào tử/cm2
).
(3) Ngay sau khi nảy mầm, bào tử của các nấm sẽ tiết ra các chất trao đổi chất, giống kháng sinh để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm lạ.
(4) Tạo môi trường pH thấp 5 – 5,5 thuận lợi hơn cho sự phát triển của nấm, ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
(5) Sử dụng dụng cụ, thiết bị và phòng nuôi cấy sạch sẽ hạn chế tối thiểu sự nhiễm của nấm nuôi.
Nói chung, hai phương pháp lên men này thì phương pháp lên men xốp đạt hiệu quả cao hơn, khả năng bị nhiễm vi sinh vật lạ thấp hơn.
1.4.3. Một số chế phẩm nấm Trichoderma đã đƣợc sản xuất và ứng dụng trên thế giới và trong nƣớc thế giới và trong nƣớc
1.4.3.1. Trên thế giới:
Nền nông nghiệp hiện đại với phương thức chỉ độc canh một vài loài cây trồng trên diện tích rộng lớn, xem thuốc hóa học là một biện pháp tốt nhất để phòng trừ dịch hại trên cây trồng đã dẫn đến một loạt các hậu quả mà con người và thiên nhiên phải gánh chịu đó là:
Ô nhiễm môi trường, ô nhiễm nguồn nước gây chết cho các động vật thủy sản, gia súc, gia cầm.
Làm mất cân bằng sinh thái trong tự nhiên; tạo nòi mới kháng thuốc ở côn trùng làm tăng thêm mức độ tàn phá trên cây trồng nhiều hơn.
Tồn dư thuốc hóa học quá mức cho phép trên sản phẩm nông nghiệp, gây hại tới sức khỏe con người.
Hơn nữa, sử dụng thuốc hóa học chi phí đầu tư cao nhưng ngày càng không hiệu quả.
Do đó, cần phải nhanh chóng giảm bớt lượng thuốc sử dụng hoặc chuyển sang chế phẩm vi sinh nhằm khắc phục các hậu quả trên.
- 29 -
Từ những thực tại đó, trên thế giới hiện nay đã có nhiều quốc gia sự dụng chế phẩm vi sinh để trừ sâu bệnh hại cây trồng. Theo Dunin (1979) ở Liên Xô cũ đã sử dụng chế phẩm Trichoderma (từ nấm Trichoderma lignorum) trên cây bông vải làm giảm 15 – 20% bệnh héo do nấm Verticillium và làm tăng năng suất 3 – 9 tạ bông/ha. Sử dụng chế phẩm Trichoderma cũng làm giảm 2,5 – 3 lần bệnh thối rễ cây non ở thuốc lá và rau màu. Trong những thập kỉ 80, chế phẩm Trichoderma ở Liên Xô cũ đã sử dụng trên diện tích 3.000ha (Filippa, 1987), sử dụng 30 – 40g/m2
chế phẩm (Badai, 1986). Chế phẩm nấm Trichoderma ở Liên Xô cũ có tên thương mại là
Trichodermin với 4 dòng chế phẩm:
Trichodermin 1: Nấm nhân nuôi trên môi trường dinh dưỡng giàu chất đạm và chất bột.
Trichodermin 2: Nấm nhân nuôi trên môi trường các phụ liệu thực vật. Trichodermin 3: Nấm nhân trên môi trường than bùn sấy khô.
Trichodermin 4: Là nấm được nhân theo phương pháp cấy sâu các nguồn nấm
Trichoderma lignorum.
Ngoài ra, còn có một số chế phẩm khác từ nấm Trichoderma đang được các quốc gia trên thế giới sử dụng như:
Pencellase, Onzuka (Nhật): từ T.viride chứa nhiều enzyme cellulase, hemicellulase.
Furfural: ở Trung Quốc có sản xuất chế phẩm cellulase từ T.konigii áp dụng trong nuôi nấm men thu Furfural.
Rootshield, T – 22 Planterbox, Top – shield, Turfshield (from Biowork Inc), Bio- Trek (Wilbur – Ellis Co): từ T.harzianum (Rifai Strain KRL – AG2), vi sinh vật có lợi dùng xử lý hạt, rễ và đất để phòng ngừa bệnh hại rễ, cũng có thể sử dụng trên lá để ngăn ngừa bệnh.
Bioderma (From Biotech International. ltd): từ T.viride nấm đối kháng và ký sinh trên nấm bệnh cây, kích thích tăng trưởng và nảy mầm hạt. Dùng kiểm soát bệnh sương mai, phấn trắng, đốm lá, thối rễ, thối thân.
- 30 -
1.4.3.2. Ở trong nước
Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng Bằng Sông Cửu long và Đông nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani. Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. Lợi dụng đặc tính này người ta đã trộn nấm Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng. Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của Công ty Anh Việt (TP. Hồ Chí Minh) phân VK của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai) đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoan nghênh và ứng dụng hiệu quả (theo TS Dương Hoa Xô, 2005).
Một số sản phẩm chế phẩm nấm Trichoderma trên thị trường Việt Nam:
TRI-CAB – sản phẩm thử nghiệm của TRUNG TÂM SINH HỌC ỨNG DỤNG – Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh: một chế phẩm sinh học chứa thành phần chính là các vi sinh vật
Trichoderma và các enzyme thủy phân như cellulase, chitinase, xylanase, hemicellulase, giúp cho cây trồng kháng bệnh.
Chế phẩm vi sinh Tam Nông Trichoderma – Công ty TNHH TAM NÔNG: Trong 1 gam chế phẩm Tam Nông Trichoderma có 2 triệu bào tử Trichoderma konigii M8, M32, M65 được tuyển chọn từ các thể đột biến bằng kỹ thuật hạt nhân, bền với thuốc trị nấm bệnh hóa học khi ra đồng.
BIMA – Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. Hồ Chí Minh (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn): chứa nấm đối kháng Trichoderma có khả năng tiêu diệt và khống chế được các loại nấm bệnh hại cây trồng, gây thối rễ, chết yểu, héo rũ.
- 31 -
PHẦN 2: NỘI DUNG – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu 2.1.1.1. Các chủng nấm Trichoderma sp. 2.1.1.1. Các chủng nấm Trichoderma sp.
Trichoderma (T40, T14) lấy từ Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt. Giống nấm
Trichoderma còn trong giai đoạn thử nghiệm.
2.1.1.2. Các chủng nấm gây bệnh hại cây trồng
Fusarium sp., Phytophthora sp. lấy từ Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.Hồ Chí Minh.
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 2.1.2.1. Dụng cụ 2.1.2.1. Dụng cụ
Các dụng cụ thủy tinh thông dụng dùng cho phân tích của phòng thí nghiệm.
2.1.2.2. Thiết bị
Tủ sấy MEM MERT, Germary
Tủ cấy ESCO AIRS TREAM, Indonesia Nồi hấp HL – 340 SPEEDS AUTOCLEVA
2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy
2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy nấm bệnh và Trichoderma sp.và khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp giữa nấm gây bệnh với chủng Trichoderma sp.: môi trường đối kháng trực tiếp giữa nấm gây bệnh với chủng Trichoderma sp.: môi trường PGA (peptone glucose agar)
a. Thành phần môi trường
Khoai tây 200g Glucose 20g Agar 20g