Địa điểm nghiên cứu

Luận văn được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp tìm kiếm thông tin về trình tự gen mã hóa cho enzyme CAD và CCR trên ngân hàng gen quốc tế CAD và CCR trên ngân hàng gen quốc tế

Thông tin về promoter của gen mã hóa cho enzyme CAD và trình tự nucleotide của gen mã hóa cho enzyme CCR được khai thác trên cơ sở dữ liệu NCBI có địa chỉ tại http://www.ncbi.nlm.nih.gov [30].

2.2.2. Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng promoter của gen CAD và gen CCR và gen CCR

Dựa trên trình tự nucleotide của gen mã hóa cho enzyme CCR của cây bạch đàn Eucalyptus gunnii (Genbank) có mã số X75480 và khai thác dữ liệu trong ngân hàng gen để tìm ra các trình tự gen CCR của bạch đàn và các đối tượng có liên quan. Sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để so sánh các trình tự cDNA của gen CCR với nhau nhằm thiết kế mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn cDNA của gen CCR và trình tự promoter EuCAD. Trên cơ sở đó đoạn cDNA của gen CCR và promoter của gen CAD được nhân bản sử dụng các cặp mồi như sau:

1. Cặp mồi nhân bản đoạn promoter CAD1 kích thước khoảng 987 bp

Trình tự mồi Kích thƣớc

Mồi xuôi (Forward) 5’-ctgcagtgaacggttcgatctcaaca-3’ 26 nucleotide

2. Cặp mồi nhân bản đoạn promoter CAD2 kích thước khoảng 1149 bp

Trình tự mồi Kích thƣớc

Mồi xuôi (Forward) 5’-cacgttctctgacgccctat-3’ 20 nucleotide

Mồi ngược (Rev) 5’-ctcatctctgctcctacccg-3’ 20 nucleotide

3. Cặp mồi nhân bản đoạn cDNA của gen CCR kích thước khoảng 1156 bp

Trình tự mồi Kích thƣớc

Mồi xuôi (Forward) 5’-cacccacctcctgaacccctctc-3’ 23 nucleotide Mồi ngược (Rev) 5’-ctgcagtcatccctgaatacgcac-3’ 24 nucleotide

2.2.3. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA từ mô gỗ

2.2.3.1. Quy trình tách chiết DNA tổng số từ mô gỗ bạch đàn:

 Hóa chất

Bảng 2.1: Thành phần dung dịch đệm tách chiết

STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng Trong 20ml

1 Tris – HCl 1 M, pH = 8,0 0,1 M 2ml 2 NaCl 5 M 1,4 M 5.6ml 3 EDTA 0,5 M 0,02 M 0.8ml 4 CTAB 2% 0.4g 5 H2O 11.2ml  Quy trình:

 Cân 200 mg mẫu và nghiền cẩn thận trong nitơ lỏng bằng cối chầy sứ cho đến khi thành dạng bột mịn.

 Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách chiết DNA và trộn đều bằng cách đảo ngược nhẹ.

 Ủ ở nhiệt độ 650

 Thêm 600µl dung dịch Chloroform: Isoamyl (24: 1) và đảo đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng.

 Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40C, Trong 5 phút. Dùng pipette hút lấy 500µl dịch sang ống Eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá.

 Thêm 500µl isopropanol lạnh, ủ hỗn hợp trong đá 15 phút. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40C, trong 10 phút.

 Loại bỏ phần dịch nổi phía trên rửa DNA kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1 lần). Ly tâm 13000 v/p và làm khô DNA kết tủa ở đáy ống eppendorf.

 Thêm 50µl nước khử ion và 2µl RNAse, ủ ở 370C trong 30 phút.

 Bảo quản DNA tổng số ở -200C.

 Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA

Việc xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA được thực hiện bằng cách đo độ hấp thụ tia UV ở các bước sóng 230, 260, 280 nm trên máy đo quang phổ. Khi đó DNA có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 260 nm. Từ giá trị OD260 ta sẽ tính được hàm lượng của DNA thu được (giá trị OD = 1,0 tương ứng với hàm lượng DNA là 50 µg/l mẫu). Độ tinh sạch của DNA có thể được xác định bằng tỷ số OD260/280 và OD260/OD230. Các tỷ số này lần lượt chỉ ra sự có mặt của tạp chất là protein, các hợp chất polyphenol và cacbon hydrate. Một mẫu DNA được coi là tinh sạch nếu tỷ số OD260/280 và OD260/OD230 đạt 1,8 – 2,0.

 Các bước đo được tiến hành như sau:

 Chỉnh cân bằng máy: dùng nước cất 2 lần khử ion, vô trùng để làm chuẩn.

 Kiểm tra máy: đo một mẫu DNA có nồng độ chuẩn đã biết trước (DNA của thực khuẩn thể λ).

 DNA được pha loãng 200 lần theo công thức: lấy 995µl nước cất + 5µl DNA mẫu, lắc đều, cho vào cuvette, đặt vào máy đo.

 Sau mỗi lần đo phải rửa sạch cuvette bằng nước cất.

 In kết quả đo được.

 Hàm lượng và độ sạch của DNA được tính theo công thức:

o Hàm lượng DNA: E = 50 x HSPL x OD260

o Độ sạch của DNA: OD260/280 và OD260/OD230

Trong đó: E: Hàm lượng DNA (ng/µ). 50: Hằng số.

HSPL: Hệ số pha loãng.

OD230: Chỉ số đo được ở bước sóng 230 nm. OD260: Chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm. OD280: Chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm.

2.2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số

 Hóa chất

Bảng 2.2: Thành phần dung dịch đệm tách chiết

STT Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng Trong 20 ml

1 Tris – HCl 1 M, pH = 8,0 0,1 M 2 ml 2 NaCl 5 M 2 M 8 ml 3 EDTA 0,5 M 0,0625 M 2.5 ml 4 CTAB 2% 0.4g 5 PVP 2% 0.4g 6 -mercaptoethanol 2% 0.4 ml 7 H20 (khử ion) Tổng 7.1 ml

Ủ ở 650C đến khi CTAB tan hoàn toàn.

 Cân 200 mg mẫu và nghiền kĩ trong nitơ lỏng bằng cối chầy sứ cho đến khi thành dạng bột mịn.

 Bổ sung thêm 700µl dung dịch đệm tách và trộn đều bằng cách đảo ngược nhẹ.

 Ủ ở nhiệt độ 650C khoảng 10 phút

 Thêm 700µl dung dịch Chloroform : Isoamyl (24 : 1) và đảo đều, để 5 phút ở nhiệt độ phòng.

 Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p, ở 40

C, trong 20 phút. Dùng pipet hút lấy 600µl dịch sang ống Eppendorf 1,5 ml, ủ vào đá.

 Thêm 150µl dung dịch muối LiCl 10M để ở 40C qua đêm. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 v/p ở 40

C, trong 10 phút.

 Loại bỏ phần dịch nổi phía trên sau đó rửa kết tủa dưới đáy ống bằng cồn 70% (1 đến 2 lần). Ly tâm 13000 v/p và làm khô kết tủa ở đáy ống eppendorf.

 Thêm 50 µl nước khử ion và điện di kiểm tra sản phẩm.

2.2.3.3. Phương pháp khử DNA Bảng 2.3: Thành phần phản ứng khử DNA STT Thành phần Thể tích (μl) 1 Mẫu RNA 8 μl 2 Đệm 10X 1 μl 3 DNAse 1 μl 4 Tổng 10 μl Quy trình:  Ủ hỗn hợp trên ở 370 C trong 30 phút.

 Ủ ở 650

C trong 10 phút.

 Điện di kiểm tra sản phẩm.

2.2.4. Phương pháp tổng hợp cDNA

RNA tổng số được sử dụng để nhân gen bằng phương pháp tổng hợp cDNA theo quy trình sau:

Bảng 2.4A: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA

STT Thành phần Thể tích (μl)

1 Mẫu RNA tổng số 2 μl

2 Mồi ngẫu nhiên (0,2g/l) 1 μl

3 Nước khử DEPC 9 μl

4 Tổng 12 μl

- Ủ hỗn hợp ở 700C trong 5 phút.

- Tiếp tục bổ sung thêm hỗn hợp sau đây:

Bảng 2.4B: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA

STT Thành phần Thể tích (μl)

1 Đệm 5X 4 μl

2 Ribolock ribonuclease inhibitor 1 μl

3 10mM dNTPs 2 μl

- Ủ ở 250C trong 5 phút.

- Cuối cùng bổ sung thêm 1 μl Revert Aid H Minus M-MuLV RT. - Tiến hành đặt hỗn hợp trong chu trình nhiệt sau:

Bảng 2.4C: Chu trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA

Bƣớc Nhiệt độ (0

1 250C 10 phút

2 420C 60 phút

3 720C 10 phút

2.2.5. Phương pháp khuếch đại đoạn promoter EuCAD và đoạn cDNA CCR bằng phản ứng PCR CCR bằng phản ứng PCR

Sử dụng thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt như sau để tiến hành khuếch đại đoạn cDNA/promoter.

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR

STT Thành phần Nồng độ

1 Đệm PCR 10X 2,5 µl

2 MgCl2 (25mM) 2,5 µl

3 dNTPs (10 mM) 2,0 µl

4 Taq DNA polymerase (5 đơn vị/µl) 0,5 µl

5 DNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 1 µl

6 Nước khử ion 15,5 µl

7 Mồi xuôi (10 pmol/µl) 0,5 µl

8 Mồi ngược (10 pmol/µl) 0,5 µl

94oC Tm 72oC 72oC 4oC 30 giây 45 giây 1 phút 30 giây 10 phút ∞ 35 chu kỳ 5 phút 94oC

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

Hình 2.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

2.2.6. Phương pháp tách dòng

2.2.6.1. Tinh sạch và gắn đoạn cDNA/promoter vào vector tách dòng pBT

 Tinh sạch sản phẩm PCR:

 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm.

 Bổ sung đệm hòa tan (QG) theo tỉ lệ: Vmẫu : V QG = 1 : 3 ( 1 µl tương ứng với 1 mg mẫu).

 Ủ ở 500

C 15 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn.

 Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel Qiaquick spin column, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.

 Bổ sung thêm 500µl QG, ly tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột.

 Thêm 750µl đệm rửa PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

 Ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết PE.

 Hòa tan DNA trong 30 – 50µl H20 khử ion đã được làm ấm đến 500C để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000 v/p trong 1 phút.

 Điện di kiểm tra sản phẩm.

 Gắn đoạn cDNA/promoter vào vector tách dòng pBT:

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng gắn đoạn cDNA/promoter vào vector tách dòng STT Thành phần Thể tích 1 DNA 13 µl 2 Ligation buffer 10X 2 µl 3 Vector pBT 2 µl 4 PEG 4000 2 µl 5 T4 ligase 1 µl Tổng 20 µl

Hỗn hợp trên được ủ ở 22oC trong 2 giờ, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α.

2.2.6.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

 Tạo tế bào khả biến:

 Tế bào E.coli DH5α được cấy ra môi trường LB đặc và nuôi qua đêm ở 370C.

 Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 5 ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370

C, qua đêm.

 Hút 1% dịch khuẩn ở trên cho vào 50ml LB, lắc 200 v/p, ở 370

C trong 2-3 giờ. Đo OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch sang cấy ống ly tâm, để 15 phút trong đá (hoặc ở 40

C).

 Ly tâm 4000 v/p, ở 40

C, trong 5 phút (lặp lại 3 lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban đầu, sau đó bổ sung 15 – 20% glycerol.

 Chia 50µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống Eppendorf 2,5ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh – 840

C.

 Biến nạp:

 Bổ sung 5µl vectơ đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp được đặt trong đá 15 phút. Với nhiệt độ lạnh để mẫu trên đá và sau 30 phút đặt ngay hỗn hợp vào bể ổn nhiệt ở 42 0C chính xác 1 phút 30 giây

 Sau khi sốc nhiệt, hỗn hợp được đặt ngay vào đá trong thời gian 5 phút.

 Bổ sung 150 - 300µl môi trường LB lỏng. Hỗn hợp được nuôi ở 370C, lắc 200 v/p trong vòng 1 giờ.

 Sử dụng que cấy trải đã khử trùng trải 150 – 250 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc có chứa kháng sinh phù hợp (pBT: 100mg/l ampicillin, X-gal 0,004 ‰, IPTG 100µM; pENTR: 50mg/l kanamicine; pBENDER 50mg/l carbenicillin).

 Ủ đĩa petri ở 370

2.2.6.3. Tách chiết plasmid tái tổ hợp

Bảng 2.7: Thành phần hoá chất tách plasmid

Ký hiệu Thành phần

Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM ETDA pH8

Sol II 0.2 NaOH, SDS 1%

Sol III 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20 Chú ý: Sol I phải khử trùng ở 117oC và giữ ở 4oC [26].

SDS (Sodium dodecyl sulfate) pha mới trước khi dùng

 Các bước tiến hành:

 Lấy 1 khuẩn lạc nuôi qua đêm ở 370C trong 3ml môi trường LB (có chứa kháng sinh thích hợp).

 Lấy 2ml dịch khuẩn nuôi cho vào ống Eppendorf 2ml, ly tâm 8000 v/p trong 2-3 phút.

 Loại dịch nổi, thu cặn, sau đó bổ sung 200µl sol I, đảo đều cho tới khi phần cặn tế bào tan hoàn toàn.

 Bổ sung 150µl sol II, đảo nhẹ bằng cách đảo ngược ống Eppendorf;

 Bổ sung 200µl sol III, đảo nhẹ bằng cách đảo ngược ống Eppendorf, sau đó ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.

 Thu dịch nổi sau đó bổ sung hỗn hợp chloroform: isoamyl (24 : 1), đảo nhẹ. Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút.

 Thu phần dịch nổi sau đó bổ sung isopropanol lạnh theo tỉ lệ 1 : 1.

 Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút sau đó thu tủa.

 Bổ sung 500µl cồn 70%, lắc nhẹ sau đó ly tâm 13000v/p trong 10 phút.

 Lặp lại bước rửa cồn 70%. Thu tủa sau đó làm khô trong thời gian 15- 20 phút.

 Tiến hành điện di kiểm tra sản phấm tách plasmid trên gel agarose 0,9%. 2.2.6.4. Phương pháp cắt plasmid Bảng 2.8: Thành phần phản ứng cắt STT Thành phần Thể tích 1 Đệm 10x 1 μl 2 Plasmid 5 μl 3 Enzyme cắt hạn chế 0,5 μl 4 H2O khử ion 3,5 μl 5 Tổng thể tích 10 μl

- Ủ hỗn hợp dung dịch ở 370C trong 2 giờ.

- Điện di kiểm tra kết quả.

2.2.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Bảng 2.9: Thành phần phản ứng colony-PCR

STT Thành phần Nồng độ

1 Đệm PCR 10X 2,5 µl

2 MgCl2 (25mM) 2,5 µl

3 dNTPs (10 mM) 2,0 µl

4 Taq DNA polymerase (5 đơn vị/µl) 0,5 µl

5 DNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 1 µl

6 Nước khử ion 15,5 µl

7 Mồi xuôi (10 pmol/µl) (pUC18 F) 0,5 µl

8 Mồi ngược (10 pmol/µl) (pUC18 R) 0,5 µl

94oC 530C 72oC 72oC 4oC 30 giây 45 giây 1 phút 30 giây 10 phút ∞ 30 chu kỳ 5 phút 94oC

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Hình 2.3: Chu trình nhiệt của phản ứng colony-PCR

2.2.8. Phương pháp Gateway

2.2.8.1. Dòng hóa đoạn cDNA của gen CCR quan tâm vào vector nhân dòng pENTRTM/D-TOPO®

+ Phương pháp thiết kế mồi nhân đoạn cDNA của gen CCR quan tâm + Phương pháp PCR nhân đoạn cDNA của gen CCR

+ Thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel

+ Tạo plasmid tái tổ hợp pENTRTM/D-TOPO® có gắn đoạn cDNA của gen CCR (ký hiệu: pENTR/CCR)

Vector pENTRTM/D-TOPO là vector tiếp nhận có kích thước 2580 bp, trên vector này có hai vị trí attL1 và attL2, đoạn gen cần chuyển sẽ được gắn vào giữa hai vị trí này. Ngoài ra trên vector này còn có gen kháng kháng sinh kanamycin và vị trí gắn mồi pUC18 phục vụ cho việc chọn các dòng khuẩn lạc mang plasmid mong muốn. Đặc biệt, nhờ enzym topoisomerase I có sẵn trên vector nên việc thực hiện phản ứng gắn gen vào vector xảy ra với thời gian rất ngắn (chỉ mất 5 phút) và đạt hiệu quả rất cao lên tới 90%. Thành phần phản ứng ghép nối như sau:

Bảng 2.10. Thành phần phản ứng ghép nối STT Thành phần Thể tích 1 DNA 0,5 - 4l 2 Salt solution 1l 3 H20 khử ion 0 – 3,5l 4 Vector pENTR 1l 5 Tổng thế tích 6l

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Đặt phản ứng trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5.

+ Biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả biến E.coli

DH5.

+ Chọn dòng bằng các phương pháp:

 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) sử dụng mồi pUC18.

 Tách chiết plasmid theo bộ kit Plasmid Extraction Kit (Bioneer).

Bảng 2.11. Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR

STT Thành phần Thể tích

1 Đệm 10X 2l