tổng hợp lignin
Có thể nói rằng cinnamoyl CoA reductase là một trong hai enzyme quan trọng tới sự hình thành các phân tử monolignol, tiền chất của lignin, ở thực vật. Trong quá trình này, các phân tử cinnamolyl CoA ester, là tiền chất của các phân tử monolignol, được hình thành từ chu trình sinh tổng hợp các phenylpropanoid sau đó được chuyển hóa thành các phân tử monolignol thông qua các phản ứng được xúc tác bởi hai enzyme là cinnamoyl CoA reductase (CCR) và cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) [28]. Trong đó CCR xúc tác cho các phản ứng tiêu thụ NAPDH chuyển hóa p-coumaroyl CoA, feruloyl CoA và sinapoyl CoA thành các dạng aldehyde tương ứng. Chính vì CCR xúc tác cho phản ứng chuyển hóa 3 dạng cơ chất khác nhau nên cho đến nay các nhà khoa học vẫn đang đặt ra câu hỏi rằng liệu trong cây CCR tồn tại ở các dạng isoform khác nhau hay chỉ duy nhất một dạng isoform có phổ xúc tác rộng với cả 3 loại cơ chất trên, ví dụ thực vật hạt kín là sinapoyl CoA [8]. Ở cây Arabidopsis các nhà khoa học đã phân lập được hai isoform của CCR là AtCCR1 và AtCCR2, và tương tự như vậy ở cây ngô là ZmCCR1 và ZmCCR2, mặc dù khi thực hiện các nghiên cứu chức năng thì chỉ một trong hai dạng isoform này tham gia vào quá trình lignin. Ngay cả ở
cây Arabidopsis cũng tồn tại khoảng 8 dạng protein có trình tự giống với
đàn, bạch dương, thuốc lá, mía đường và cây thông, chỉ duy nhất một gen mã hóa cho enzyme CCR được xác định cho đến thời điểm hiện tại [8]. Do đó nếu ở thực vật tồn tại các dạng isoform khác nhau đặc hiệu cho từng cơ chất ở các dạng tế bào khác nhau thì có thể các enzyme này được mã hóa bởi các gen có độ tương đồng rất thấp với CCR, và/hoặc các gen này chỉ được biểu hiện tạm thời và rất khó phát hiện [7].
Năm 1998, Piquemal và cộng sự đã chỉ ra rằng CCR giữ vai trò trong việc điều tiết nguồn cacbon trong chu trình tổng hợp các loại monolignol. Chính vì lý do này mà CCR được coi là bước tổng hợp đặc hiệu lignin đầu tiên trong chu trình phenylpropanoid. Tuy nhiên ở trong tế bào thực vật, các phân tử monolignol không chỉ dùng cho quá trình sinh tổng hợp lignin mà còn được dùng để tổng hợp các phân tử lignan và cinnamaldehyde và các sản phẩm có nguồn gốc monolignol. Hơn nữa, nếu quá trình sinh tổng hợp các phân tử monolignol được thực hiện đầy đủ và liên tục như giả thiết, ví dụ như đối với các quá trình đường phân và pentose phosphate, thì CCR sẽ không giữ chức năng điều hòa. Tuy nhiên, ở các dòng cây đột biến làm giảm tối đa hoạt động của CCR xuất hiện những dấu hiệu bất thường về sinh lý trong quá trình sinh trưởng và ngay cả hoạt tính enzyme của các bước trong chu trình sinh tổng hợp monolignol cũng bị giảm. Ví dụ, nếu hoạt tính của CCR bị ức chế hoàn toàn thì sự tích lũy các phân tử cinnamoyl CoA ester tương ứng sẽ giảm xuống do nguồn CoA bị giới hạn. Trong khi các phân tử cinnamoyl CoA ester này sẽ bị giới hạn để tổng hợp nên thành tế bào đang ở trong trạng thái lignin hóa, nguồn CoA giới hạn cũng sẽ kéo theo những ảnh hưởng đến các quá trình sinh tổng hợp khác trong tế bào (trừ khi chu trình phenylpropanoid được thay thế hoàn toàn). Vì vậy có thể xem rằng nguồn cacbon dùng cho chu trình phenylpropanoid sẽ được sử dụng, hoặc là để tổng hợp phân tử trung gian (bao gồm các phân tử CoA ester) hoặc là tổng hợp các sản phẩm cuối cùng.
Khi nguồn các phân tử monolignol giảm sẽ dẫn đến sự thay đổi đáng kể bộ máy bó mạch, tuy nhiên những nhận định này vẫn còn đang được các nhà khoa học tìm lời giải đáp. Khi chuyển đoạn đối mã (antisense) của gen CCR vào cây thuốc lá thì các dòng cây chuyển CCR.H (p-coumaryl) gen xuất hiện những thay đổi bất thường trong quá trình sinh trưởng và phát triển như lá nhỏ, tròn dạng thìa và màu sắc tối hơn so với cây không chuyển gen và các dạng chuyển gen khác. Ở các dòng cây chuyển gen này thì hàm lượng lignin cũng giảm đáng kể. Khi quan sát các lát cắt thân cho thấy nhiều yếu tố mạch bị đứt gẫy [7] (Hình 1.3).
Hình 1.3: Lát cắt thân cây chuyển gen CCR.H (A) và cây không chuyển gen (B)
Thực hiện các thí nghiệm liên quan đến độ bền của thân cũng bị ảnh hưởng do các thành phần bó mạch bị yếu bởi sự mất cân bằng hàm lượng lignin. Những kết quả này cũng được khẳng định lại bởi các nghiên cứu trên dạng đột biến irx4 (thiếu hụt enzyme CCR). Hàm lượng lignin ở các dạng đột biến này giảm khoảng 50%. Thân cây rất mẫn cảm dưới tác động của các yếu tố cơ học [24]. Năm 2001, Chabannes và cộng sự chỉ ra rằng khi hoạt tính CCR giảm (khoảng 3% so với dạng ban đầu), thì sự hình thành monolignol
giảm dẫn đến hàm lượng lignin giảm tối đa 50% so với cây không chuyển gen. Trong đó thành phần giảm chủ yếu là signapyl và coniferyl.
Ở cây bạch đàn, đoạn gen mã hóa cho CCR mới chỉ được xác định đầy đủ ở cây bạch đàn gunnii (Eucalyptus gunnii) và đã được đăng kí trên trên cơ sở dữ liệu NCBI [30]. Và đối với cây bạch đàn uro thì đây là công trình tách dòng đầu tiên ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Năm 2006, các nhà khoa học Pháp công bố tương đối chi tiết đến hoạt động và chức năng của promoter của gen mã hóa cho enzyme CCR ở cây bạch đàn. Kết quả chỉ ra rằng gen chỉ thị được điều khiển bởi promoter này biểu hiện mạnh đặc biệt ở các tế bào đang trong giai đoạn lignin hóa. Phân tích chi tiết hơn sự biểu hiện của gen mã hóa cho enzyme CCR trên cây Arabidopsis cũng cho thấy quá trình lignin hoá của các tế bào tần xylem diễn ra rất giống nhau ở cả mô xylem sơ cấp và thứ cấp [7].
Những bằng chứng khoa học về vai trò của enzyme CCR đến hàm lượng lignin và quá trình lignin hóa của các tế bào cho thấy đây là một enzyme quan trọng, tiềm năng và có ý nghĩa ứng dụng trong cải tạo giống cây lâm nghiệp theo hướng làm giảm thiểu lượng lignin trong cây.
CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu