Sau khi thiết kế thành công mồi cho gen mã hóa enzyme cinnamoyl coA reductase (CCR) thì yêu cầu tiếp theo là tách chiết được RNA từ mẫu gỗ bạch đàn đảm bảo chất lượng tốt cho những thí nghiệm tiếp theo. Để đáp ứng yêu cầu này chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết RNA tổng số là
phương pháp CTAB. Các mẫu RNA tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose nồng độ 1%. Kết quả được thể hiện ở hình 3.15:
Hình 3.15. Kết quả điện di RNA tổng số M: Thang DNA 1kb Hình 3.16. Kết quả điện di khử DNA M: Thang DNA 1kb
Từ kết quả hình 3.15 cho thấy, chúng tôi đã tách chiết thành công RNA từ mẫu gỗ bạch đàn. Tuy nhiên hàm lượng DNA trong dịch tách còn cao (được thể hiện ở băng vạch đầu tiên của đường chạy), do đó chúng tôi tiến hành khử DNA theo quy trình đã được mô tả ở mục 2.2.3.3 và thu được kết quả trên hình 3.16.
3.2.3. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của phản ứng PCR như: nồng độ dung dịch mẫu, nồng độ Mg++, chu trình nhiệt ... và đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi. Thông thường, ở nhiệt độ càng cao thì mức độ đặc hiệu càng tăng vì tránh được hiện tượng nhiễm các nguồn gen lạ. Do đó, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ bắt mồi của phản ứng PCR trên dải nhiệt độ từ 500C đến 600
có sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế ở trên với các thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở bảng 2.5 và hình 2.1.
Kết quả trên hình 3.17 cho thấy ở tất cả các dải nhiệt độ đều xuất hiện một phân đoạn DNA đặc hiệu có kích thước khoảng 1156bp, phù hợp với kích thước phân đoạn dự đoán khi thiết kế mồi. Tuy nhiên ở nhiệt độ bắt cặp mồi 600C xuất hiện một phân đoạn có kích thước sáng rõ nét nhất. Do đó, có thể xác định nhiệt độ bắt mồi đặc hiệu nhất của phản ứng PCR với đoạn cDNA của gen CCR là 600
C. Từ đó, chúng tôi sơ bộ kết luận đã nhân bản thành công đoạn cDNA của gen CCR bằng kỹ thuật PCR và lựa chọn nhiệt độ này làm nhiệt độ gắn mồi ở các thí nghiệm tiếp theo trong quá trình tách dòng gen CCR.
Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR
M: Thang DNA 1Kb, 50 – 60: dải nhiệt độ bắt cặp của mồi trong phản ứng PCR