3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ
- Máy xử lý mẫu tự động - Máy cắt microtome
- Bàn ấm cố định mẫu trên lam kính - Bộ phận làm lạnh mẫu
- Nồi nước có điều chỉnh nhiệt độ - Bình rót paraffin Electrothermal - Kính hiển vi quang học
- Găng tay y tế, lam, lamel, cassette và nắp, đèn cồn, kéo, panh, khuôn inox, micropipette, eppendoff, becher, ống đong, bình tam giác.
3.2.4. Hóa chất
- Cồn 50%; 70%; 95%; 99,6%.
- Chloroform, Paraffin, nước cất 2 lần, nước cất khử ion, xylene, NaCl. - Thuốc nhuộm Hematoxylin, keo dán Baume Canada.
- Dung dịch Davidson với thành phần như sau: Cồn 95% : 330 ml
Formalin : 220 ml Acid acetic glacial : 115 ml Nước cất : 335 ml - Hoá chất làm lam dương:
Aceton : 250 ml
(3-aminopropyl) triethoxysaline : 5 ml
3.3. Phƣơng pháp
3.3.1. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu tạo khối đầy đủ ngẫu nhiên
(Randomized complete block design - RCBD). Số liệu được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 7.0. Dùng trắc nghiệm LSD (Least significant different) 95% để so sánh các nghiệm thức.
A. Với nội dung 1: Phát triển phương pháp IHC phù hợp với điều kiện tại Việt Nam
dựa trên qui trình đề nghị của Nauwynck và cộng sự (Đại Học Gent - Bỉ) thông qua bố trí thử nghiệm:
Khả năng nhuộm màu của các nồng độ DAB khác nhau (1X; 1,5X và 2X). Thí nghiệm trên 5 mẫu, mỗi mẫu sau khi cố định trong paraffin được bố trí trên 3 lam, mỗi lam thử nghiệm với 1 nồng độ.
Độ nhạy và tính đặc hiệu của mAb ở các nồng độ pha loãng khác nhau (0,5X; 1X; 1,5X và 2X). Thí nghiệm trên 10 mẫu, mỗi mẫu sau khi cố định trong paraffin được bố trí trên 4 lam, mỗi lam thử nghiệm với 1 nồng độ.
Kết quả được ghi nhận trên 3 đặc tính của mẫu sau khi nhuộm: Cường độ cảm nhiễm, cường độ bắt màu và độ sắc nét.
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 1 Yếu tố thử nghiệm Nồng độ DAB Nồng độ mAb 1X 1,5X 2X 0,5X 1X 1,5X 2X Kí hiệu m ẫu 45D 45D 45D 45D 45D 45D 45D 45P 45P 45P 45P 45P 45P 45P 101 101 101 101 101 101 101 53 53 53 53 53 53 53 103 103 103 103 103 103 103 97 97 97 97 50 50 50 50 98 98 98 98 453 453 453 453 99 99 99 99
B. Với nội dung 2: So sánh phương pháp IHC về độ ổn định, độ nhạy, độ chính xác và
hiệu quả với phương pháp mô học truyền thống và PCR qua bố trí thử nghiệm khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV trên 25 mẫu tôm post-larvae và 30 mẫu tôm thương phẩm. Mỗi mẫu được chia thành 2 phần, một phần cố định trong cồn dùng cho PCR, phần còn lại cố định trong dung dịch Davidson cho Mô học và IHC (sau khi cố định trong paraffin, mỗi mẫu được cắt và bố trí trên 2 lam, một cho IHC và 1 cho Mô học).
Kết quả được ghi nhận dựa trên tỉ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm của mẫu sau khi xét nghiệm.
Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 2 Đối
tƣợng Tôm post-larvae Tôm thƣơng phẩm
Loại xét
nghiệm PCR Mô học IHC PCR Mô học IHC
Kí hiệu m ẫu 7638 7638 7638 101 101 7787 7787 7787 97 97 7661 7661 7661 98 98 7781 7781 7781 99 99 7536 7536 7536 336 336 7786 7786 7786 341 341 7718 7718 7718 342 342 7769 7769 7769 340 340 7768 7768 7768 339 339 7764 7764 7764 338 338 7684 7684 7684 103 103 103 7691 7691 7691 44 44 44 7650 7650 7650 55 55 55 7722 7722 7722 57 57 57 7725 7725 7725 49 49 49 2682 2682 2682 94 94 94 2741 2741 2741 136 136 136 2708 2708 2708 134 134 134 3122 3122 3122 137 137 137 2752 2752 2752 135 135 135 2745 2745 2745 159 159 159 12964 12964 12964 161 161 161 2794 2794 2794 152 152 152 2746 2746 2746 153 153 153 7755 7755 7755 156 156 156 178 178 178 179 179 179 181 181 181 182 182 182 185 185 185
3.3.2. Quy trình thực hiện: Quy trình thực hiện gồm 3 giai đoạn chính
Hình 3.1. Sơ đồ tổng quát quy trình chẩn đoán bằng IHC Giai đoạn 1: Xử lý mẫu (tương tự như phương pháp mô học truyền thống)
Bước 1: Cố định mẫu trong dung dịch Davidson
Với tôm post-larvae: Vớt tôm mẫu (còn sống) để vào mảnh vải mùng
nhỏ, bỏ vào cassette và đóng nắp lại, cho trực tiếp vào dung dịch Davidson. Ngâm mẫu 24 giờ.
Với tôm thương phẩm: Lấy tôm sống, cắt giữa phần đầu ngực và bụng,
giữ phần đầu ngực lại (chứa mang và gan tụy), tiêm dung dịch Davidson vào Nhận mẫu Cố định mẫu Đúc mẫu Cắt mẫu Làm lạnh Ủ mẫu trong 24 – 72 giờ
Chuyển mẫu lên lam Nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi Ủ mẫu ở 400 C đến khi mẫu dính chặt vào lam Xử lý mẫu 12,5 giờ
gan tụy và vùng xung quanh gan tụy, lượng thuốc dùng từ 0,1 – 10 ml (thay đổi tùy kích thước tôm), sau đó cho vào lọ chứa dung dịch Davidson. Ngâm mẫu từ 24 – 72 giờ. Hoặc có thể cắt đầu tôm, tách vỏ, lấy phần mang và gan tụy, để vào mảnh vải mùng nhỏ, cho vào cassette, đóng nắp và bỏ vào dung dịch Davidson, ngâm như với tôm post-larvae.
Tỷ lệ chất cố định: mẫu =10:1 Bước 2: Xử lý mẫu.
Rửa nước 1 – 2 giờ dưới vòi nước chảy. Sau đó xử lý theo quy trình như hình 3.2. Quy trình này được thực hiện bằng máy.
Tổng thời gian xử lý mẫu là 12,5 giờ.
Hình 3.2. Sơ đồ xử lý mẫu
Bước 3: Đúc mẫu
Đặt mẫu nằm sát đáy khuôn chứa nến có tỉ lệ parafin: sáp ong = 1:5, đậy cassette lên khuôn để khi nến đông lại và dính vào cassette. Quá trình này cần có bàn nóng và bình rót nến.
Đặt khuôn lên bề mặt bộ phận làm lạnh, đợi đến khi khuôn mẫu lạnh, tách khối paraffin ra khỏi khuôn và đặt lên bề mặt làm lạnh sao cho mặt cắt lạnh cứng lại.
Bước 4: Cắt mẫu: Cắt khối paraffin chứa mẫu bằng máy cắt microtome, kích thước mỗi lát cắt là 5 μl.
Bước 5: Chuyển lát cắt vào nồi nước ấm 400C, dùng lam dương vớt lát cắt. Cồn 70% 30 phút Cồn 95% (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (3) 30 phút Cồn 95% (2) 30 phút Cồn 95% (3) 30 phút Cồn tuyệt đối (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (2) 30 phút Chloroform (1) 1,5 giờ Chloroform (2) 1,5 giờ Paraffin (1) 3 giờ Paraffin (2) 3 giờ
Giai đoạn 2: Nhuộm lát cắt theo phương pháp IHC
Bước 1: Làm mẫu dính chặt vào lam: Đặt lam chứa mẫu vào bàn ấm ở nhiệt độ 450C đến khi khô hết nước và mẫu không di chuyển được.
Bước 2: Khử paraffin cho mô
Xylene 1 – 2 lần 5 phút/lần Ethanol 100% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 70% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần Nhúng trong Tris buffer pH 7,6 + NaCl 1 lần trong 5 phút.
Bước3: Ngăn hoạt động của enzyme peroxidase nội bào: Pha dung dịch gồm sodium azide (10%), Tris - NaCl, H2O2 theo tỉ lệ 25 : 221 : 4. Lượng dung dịch cần pha phụ thuộc vào lượng lam muốn nhuộm (80μl hỗn hợp/lam). Dùng micropipette hút dung dịch và trải đều lên trên mặt mẫu.
Ủ mẫu 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần).
Bước 4: Ủ với kháng thể thứ nhất: Pha kháng thể 8B7 mAb (kháng WSSV VP28) với huyết thanh cừu 10%(100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:30. Lượng dung dịch cần pha và cách sử dụng tương tự bước 3.
Ủ mẫu 1 giờ ở 370 C .
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/ lần).
Bước 5: Ủ với kháng thể thứ hai: Pha kháng thể thứ hai (kháng thể của cừu có gắn biotin kháng lại kháng thể 1 từ chuột) với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lượng dung dịch cần pha và cách sử dụng tương tự bước 3.
Ủ mẫu trong 1 giờ ở 370 C.
Bước 6: Ủ với treptavidine-biotin HRP: Pha phức hợp streptavidine- biotinylated horseradise peroxidase với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lượng dung dịch cần pha và cách sử dụng tương tự bước 3.
Ủ mẫu trong 30 phút tại nhiệt độ phòng.
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần).
Bước 7: Làm hiển thị màu bằng DAB: Pha DAB trong Tris buffer pH 7,6 không có NaCl (0,5mg DAB/ml Tris buffer). Bổ sung ngay trước khi dùng H2O2 (30%) với tỉ lệ 3H2O2 : 5Tris buffer.
Nhúng lam mẫu vào dung dịch và ủ vài phút tại nhiệt độ phòng.
Kiểm tra sự hiện màu (màu nâu tích tụ trong tế bào nhiễm virus) trong phút đầu tiên sau khi nhúng lam vào dung dịch DAB. Dừng phản ứng bằng cách nhúng lam trong tris buffer pH 7,6 + NaCl.
Bước 8: Nhuộm tạo nền tương phản bằng cách nhúng lam vài lần vào dung dịch hematoxylin pha loãng.
Rửa cẩn thận với nước máy trong 1 phút. Bước 9: Khử nước Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 70% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 100% 1 lần 5 phút/lần. Xylene 1 – 2 lần 5 phút/lần. Bước 10: Dán lamel với Baume Canada.
Lam sau khi lấy ra khỏi xylene để khô trong vài phút, nhỏ một giọt keo Baume Canada ngay trên tiêu bản mẫu, đặt lamel lên lam kính, tránh hiện tượng có bọt khí bên trong.
Giai đoạn 3: Đọc kết quả. Cách đọc tiêu bản xác định thể ẩn và ghi nhận kết quả như
sau:
Xem kết quả bằng kính hiển vi quang học ở vật kính 10x, 40x, 100x. Tế bào nhiễm WSSV có thể vùi dạng Crowdry A đặc trưng với nhân trương to, sau đó hạch nhân trương to hơn, chiếm hết nhân, bắt màu nâu.
Các kết quả được khảo sát dựa trên:
+ Tỷ lệ cảm nhiễm là số tôm bệnh trên tổng số tôm kiểm tra. + Cường độ cảm nhiễm là % tế bào nhiễm virus.
+ Cường độ bắt màu là % tế bào nhiễm bắt màu nâu (vì ngoài màu nâu, tế bào nhiễm còn có thể bắt màu nâu nhạt hay vàng). + Độ sắc nét là % tế bào nhiễm bắt màu sắc nét.
Kết quả xét nghiệm được mã hoá thành kí hiệu và giá trị có ý nghĩa về mặt toán học (Bảng 3.1).
Bảng 3.5. Bảng mã hoá kết quả
Nội dung Số liệu Cường độ Kí hiệu mã hoá cảm nhiễm
- 0 0% 0% 0% +/- 1 0 - 25% 0 - 25% 0 - 25% + 2 25 - 50% 25 - 50% 25 - 50% ++ 3 50 - 75% 50 - 75% 50 - 75% +++ 4 75 - 100% 75 - 100% 75 - 100% Cường độ bắt màu Độ sắc nét
Sau khi đọc kết quả, các lam chứa mẫu và các thông số đều được lưu lại. Trong suốt quá trình thực hiện cần đánh dấu mẫu cẩn thận để tránh nhầm lẫn
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả nội dung hoàn thiện quy trình nhuộm IHC 4.1. Kết quả nội dung hoàn thiện quy trình nhuộm IHC
Tất cả các thí nghiệm so sánh trên cùng một mẫu được ghi nhận kết quả trên các lát cắt liên tiếp nhau.
4.1.1. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau
Bảng 4.1. Kết quả so sánh chi tiết 3 quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên 5 mẫu thử nghiệm
Kí hiệu Cường độ cảm nhiễm Cường độ bắt màu Độ sắc nét
1X 1,5X 2X 1X 1,5X 2X 1X 1,5X 2X 45P + + + - - +/- - - +/- 45D +/- + + - + ++ - +/- +/- 101 +/- + + - + + - + + 53 +/- + + - + ++ - + ++ 103 +/- + + - + + - + +
- Nồng độ 1X: Tất cả các tế bào bắt màu DAB đều có màu vàng nhạt hay nâu rất
nhạt, một số tế bào bắt màu DAB rất mờ không thể xác định rõ có phải là tế bào nhiễm virus hay không, vì vậy mà cường độ cảm nhiễm của 4/5 mẫu thấp hơn 2 nồng độ còn lại. Nhân tế bào bắt màu DAB không có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm virus.
Ở vật kính 10x: Phải quan sát rất kĩ mới nhận ra màu nhuộm.
Ở vật kính 40x: Có thể nhận thấy màu vàng nhạt ở một số tế bào nhưng tất cả các tế bào bắt màu đều không có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm virus (nhân không tròn và trương to), không sắc nét.
Ở vật kính 100x: Một số tế bào có nhân trương to và khá tròn nhưng không sắc nét. Hình dạng nhân tạo thành bởi những chấm màu vàng hay nâu nhạt khá rời rạc.
- Nồng độ 1,5X: Lượng tế bào bắt màu DAB có màu nâu tăng lên đáng kể so với
nồng độ 1X, một số tế bào còn có màu nâu đậm. Hình dạng đặc trưng của nhân tế bào nhiễm virus thể hiện rõ ở nhiều tế bào. Vì vậy có thể xác định thêm một số tế bào nhiễm.
Ở vật kính 10x: Có thể nhận thấy rõ màu nhuộm khác biệt so với màu nền.
Ở vật kính 40x: Phần lớn tế bào bắt màu DAB đều có màu nâu hay nâu nhạt. Hình dạng nhân khá rõ ràng và sắc nét.
Ở vật kính 100x: Nhân tế bào trương to, tròn, rõ nét.
- Nồng độ 2X: Gần như tất cả các tế bào bắt màu DAB đều có màu nâu hay nâu
đậm, một số tế bào có màu nâu rất đậm, gần như đen, phần lớn tế bào có nhân rất đặc trưng của tế bào nhiễm WSSV, trương to và tròn.
Ở vật kính 10x: Màu nhuộm thể hiện rất rõ, có thể xác định ngay tế bào nhiễm.
Ở vật kính 40x: Nhân tế bào bắt màu nâu rõ nét. Nhiều tế bào có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm WSSV
Ở vật kính 100: Màu nâu thể hiện rất đậm ở một số mẫu, ngay cả ở những tế bào không có hình dạng đặc trưng vẫn rất sắc nét.
Nhìn chung, kết quả quan sát dưới kính hiển vi cho thấy có sự khác biệt đáng kể về cường độ cảm nhiễm của mẫu, cường độ bắt màu, và độ sắc nét của tế bào nhiễm khi nhuộm với DAB 1X so với nồng độ 1,5X và 2X. Nồng độ 1X có khả năng nhuộm rất kém, không thể nhận biết rõ tế bào nhiễm WSSV với nồng độ này. Nồng độ 1,5X và 2X thể hiện kết quả nhuộm tốt, nồng độ 2X có ưu thế hơn về cường độ bắt màu và độ sắc nét nhưng nhiều tế bào lại bắt màu quá đậm, không cần thiết. Ở nồng độ 1,5X chỉ có mẫu 45P bắt màu kém và không sắc nét. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân như không đủ lượng DAB, lượng virus nhiễm ít, mẫu nhuộm không tốt làm trôi màu, không đủ lượng kháng thể ... Nhưng khi so sánh kết quả nhuộm với DAB 2X, cường độ cảm nhiễm và độ sắc nét được cải thiện không đáng kể. Do đó mẫu 45P bắt màu không tốt chắc chắn không phải vì nồng độ DAB không đủ để cho phản ứng.
Như vậy, nồng độ 1,5X biểu hiện tốt nhất với quy trình nhuộm này vì không mất nhiều DAB một cách không cần thiết như nồng độ 2X nhưng vẫn cho kết quả nhuộm tốt.
Hình 4.1. Kết quả nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên mẫu 45D (tất cả hình ảnh được chụp trên cùng một vị trí mang).
A1, A2, A3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với DAB 1X (100x), (400x), (1000x).
- Hình A1: Tế bào nhiễm bắt màu nâu nhạt, lẫn với màu nền, rất khó nhận ra.
- Hình A2: Có thể nhận thấy sự khác biệt giữa màu DAB và màu nền nhưng không rõ, hình dạng tế bào nhiễm không sắc nét. Một số tế bào (mũi tên) không thể xác định được có nhiễm virus hay không.
- Hình A3: Màu DAB nhạt, không rõ nhân tế bào nhiễm
A1 A2 A3
B1 B2 B3
B1, B2, B3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với DAB 1,5X (100x), (400x), (1000x).
- Hình B1: Có thể nhận thấy rõ vị trí tế bào nhiễm, màu DAB thể hiện rõ.