4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.1. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác
Bảng 4.1. Kết quả so sánh chi tiết 3 quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên 5 mẫu thử nghiệm
Kí hiệu Cường độ cảm nhiễm Cường độ bắt màu Độ sắc nét
1X 1,5X 2X 1X 1,5X 2X 1X 1,5X 2X 45P + + + - - +/- - - +/- 45D +/- + + - + ++ - +/- +/- 101 +/- + + - + + - + + 53 +/- + + - + ++ - + ++ 103 +/- + + - + + - + +
- Nồng độ 1X: Tất cả các tế bào bắt màu DAB đều có màu vàng nhạt hay nâu rất
nhạt, một số tế bào bắt màu DAB rất mờ không thể xác định rõ có phải là tế bào nhiễm virus hay không, vì vậy mà cường độ cảm nhiễm của 4/5 mẫu thấp hơn 2 nồng độ còn lại. Nhân tế bào bắt màu DAB không có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm virus.
Ở vật kính 10x: Phải quan sát rất kĩ mới nhận ra màu nhuộm.
Ở vật kính 40x: Có thể nhận thấy màu vàng nhạt ở một số tế bào nhưng tất cả các tế bào bắt màu đều không có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm virus (nhân không tròn và trương to), không sắc nét.
Ở vật kính 100x: Một số tế bào có nhân trương to và khá tròn nhưng không sắc nét. Hình dạng nhân tạo thành bởi những chấm màu vàng hay nâu nhạt khá rời rạc.
- Nồng độ 1,5X: Lượng tế bào bắt màu DAB có màu nâu tăng lên đáng kể so với
nồng độ 1X, một số tế bào còn có màu nâu đậm. Hình dạng đặc trưng của nhân tế bào nhiễm virus thể hiện rõ ở nhiều tế bào. Vì vậy có thể xác định thêm một số tế bào nhiễm.
Ở vật kính 10x: Có thể nhận thấy rõ màu nhuộm khác biệt so với màu nền.
Ở vật kính 40x: Phần lớn tế bào bắt màu DAB đều có màu nâu hay nâu nhạt. Hình dạng nhân khá rõ ràng và sắc nét.
Ở vật kính 100x: Nhân tế bào trương to, tròn, rõ nét.
- Nồng độ 2X: Gần như tất cả các tế bào bắt màu DAB đều có màu nâu hay nâu
đậm, một số tế bào có màu nâu rất đậm, gần như đen, phần lớn tế bào có nhân rất đặc trưng của tế bào nhiễm WSSV, trương to và tròn.
Ở vật kính 10x: Màu nhuộm thể hiện rất rõ, có thể xác định ngay tế bào nhiễm.
Ở vật kính 40x: Nhân tế bào bắt màu nâu rõ nét. Nhiều tế bào có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm WSSV
Ở vật kính 100: Màu nâu thể hiện rất đậm ở một số mẫu, ngay cả ở những tế bào không có hình dạng đặc trưng vẫn rất sắc nét.
Nhìn chung, kết quả quan sát dưới kính hiển vi cho thấy có sự khác biệt đáng kể về cường độ cảm nhiễm của mẫu, cường độ bắt màu, và độ sắc nét của tế bào nhiễm khi nhuộm với DAB 1X so với nồng độ 1,5X và 2X. Nồng độ 1X có khả năng nhuộm rất kém, không thể nhận biết rõ tế bào nhiễm WSSV với nồng độ này. Nồng độ 1,5X và 2X thể hiện kết quả nhuộm tốt, nồng độ 2X có ưu thế hơn về cường độ bắt màu và độ sắc nét nhưng nhiều tế bào lại bắt màu quá đậm, không cần thiết. Ở nồng độ 1,5X chỉ có mẫu 45P bắt màu kém và không sắc nét. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân như không đủ lượng DAB, lượng virus nhiễm ít, mẫu nhuộm không tốt làm trôi màu, không đủ lượng kháng thể ... Nhưng khi so sánh kết quả nhuộm với DAB 2X, cường độ cảm nhiễm và độ sắc nét được cải thiện không đáng kể. Do đó mẫu 45P bắt màu không tốt chắc chắn không phải vì nồng độ DAB không đủ để cho phản ứng.
Như vậy, nồng độ 1,5X biểu hiện tốt nhất với quy trình nhuộm này vì không mất nhiều DAB một cách không cần thiết như nồng độ 2X nhưng vẫn cho kết quả nhuộm tốt.
Hình 4.1. Kết quả nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên mẫu 45D (tất cả hình ảnh được chụp trên cùng một vị trí mang).
A1, A2, A3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với DAB 1X (100x), (400x), (1000x).
- Hình A1: Tế bào nhiễm bắt màu nâu nhạt, lẫn với màu nền, rất khó nhận ra.
- Hình A2: Có thể nhận thấy sự khác biệt giữa màu DAB và màu nền nhưng không rõ, hình dạng tế bào nhiễm không sắc nét. Một số tế bào (mũi tên) không thể xác định được có nhiễm virus hay không.
- Hình A3: Màu DAB nhạt, không rõ nhân tế bào nhiễm
A1 A2 A3
B1 B2 B3
B1, B2, B3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với DAB 1,5X (100x), (400x), (1000x).
- Hình B1: Có thể nhận thấy rõ vị trí tế bào nhiễm, màu DAB thể hiện rõ.
- Hình B2: Tế bào nhiễm (mũi tên) thể hiện màu sắc và hình dạng đặc trưng.
- Hình B3: Vị trí X - nhân tế bào nhiễm WSSV điển hình. Vị trí Y: hạch nhân trương to, có thể thấy rõ mép nhân. Vị trí Z: tế bào nhiễm phóng thích virus.
C1, C2, C3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với DAB 2X (100x), (400x), (1000x).
- Hình C1:Dễ dàng nhìn thấy tế bào nhiễm do màu DAB quá đậm, gần như đen.
- Hình C2, C3: Nhận thấy tế bào nhiễm rất rõ và sắc nét.