3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.3.2. Quy trình thực hiện
Hình 3.1. Sơ đồ tổng quát quy trình chẩn đoán bằng IHC Giai đoạn 1: Xử lý mẫu (tương tự như phương pháp mô học truyền thống)
Bước 1: Cố định mẫu trong dung dịch Davidson
Với tôm post-larvae: Vớt tôm mẫu (còn sống) để vào mảnh vải mùng
nhỏ, bỏ vào cassette và đóng nắp lại, cho trực tiếp vào dung dịch Davidson. Ngâm mẫu 24 giờ.
Với tôm thương phẩm: Lấy tôm sống, cắt giữa phần đầu ngực và bụng,
giữ phần đầu ngực lại (chứa mang và gan tụy), tiêm dung dịch Davidson vào Nhận mẫu Cố định mẫu Đúc mẫu Cắt mẫu Làm lạnh Ủ mẫu trong 24 – 72 giờ
Chuyển mẫu lên lam Nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi Ủ mẫu ở 400 C đến khi mẫu dính chặt vào lam Xử lý mẫu 12,5 giờ
gan tụy và vùng xung quanh gan tụy, lượng thuốc dùng từ 0,1 – 10 ml (thay đổi tùy kích thước tôm), sau đó cho vào lọ chứa dung dịch Davidson. Ngâm mẫu từ 24 – 72 giờ. Hoặc có thể cắt đầu tôm, tách vỏ, lấy phần mang và gan tụy, để vào mảnh vải mùng nhỏ, cho vào cassette, đóng nắp và bỏ vào dung dịch Davidson, ngâm như với tôm post-larvae.
Tỷ lệ chất cố định: mẫu =10:1 Bước 2: Xử lý mẫu.
Rửa nước 1 – 2 giờ dưới vòi nước chảy. Sau đó xử lý theo quy trình như hình 3.2. Quy trình này được thực hiện bằng máy.
Tổng thời gian xử lý mẫu là 12,5 giờ.
Hình 3.2. Sơ đồ xử lý mẫu
Bước 3: Đúc mẫu
Đặt mẫu nằm sát đáy khuôn chứa nến có tỉ lệ parafin: sáp ong = 1:5, đậy cassette lên khuôn để khi nến đông lại và dính vào cassette. Quá trình này cần có bàn nóng và bình rót nến.
Đặt khuôn lên bề mặt bộ phận làm lạnh, đợi đến khi khuôn mẫu lạnh, tách khối paraffin ra khỏi khuôn và đặt lên bề mặt làm lạnh sao cho mặt cắt lạnh cứng lại.
Bước 4: Cắt mẫu: Cắt khối paraffin chứa mẫu bằng máy cắt microtome, kích thước mỗi lát cắt là 5 μl.
Bước 5: Chuyển lát cắt vào nồi nước ấm 400C, dùng lam dương vớt lát cắt. Cồn 70% 30 phút Cồn 95% (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (3) 30 phút Cồn 95% (2) 30 phút Cồn 95% (3) 30 phút Cồn tuyệt đối (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (2) 30 phút Chloroform (1) 1,5 giờ Chloroform (2) 1,5 giờ Paraffin (1) 3 giờ Paraffin (2) 3 giờ
Giai đoạn 2: Nhuộm lát cắt theo phương pháp IHC
Bước 1: Làm mẫu dính chặt vào lam: Đặt lam chứa mẫu vào bàn ấm ở nhiệt độ 450C đến khi khô hết nước và mẫu không di chuyển được.
Bước 2: Khử paraffin cho mô
Xylene 1 – 2 lần 5 phút/lần Ethanol 100% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 70% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần Nhúng trong Tris buffer pH 7,6 + NaCl 1 lần trong 5 phút.
Bước3: Ngăn hoạt động của enzyme peroxidase nội bào: Pha dung dịch gồm sodium azide (10%), Tris - NaCl, H2O2 theo tỉ lệ 25 : 221 : 4. Lượng dung dịch cần pha phụ thuộc vào lượng lam muốn nhuộm (80μl hỗn hợp/lam). Dùng micropipette hút dung dịch và trải đều lên trên mặt mẫu.
Ủ mẫu 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần).
Bước 4: Ủ với kháng thể thứ nhất: Pha kháng thể 8B7 mAb (kháng WSSV VP28) với huyết thanh cừu 10%(100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:30. Lượng dung dịch cần pha và cách sử dụng tương tự bước 3.
Ủ mẫu 1 giờ ở 370 C .
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/ lần).
Bước 5: Ủ với kháng thể thứ hai: Pha kháng thể thứ hai (kháng thể của cừu có gắn biotin kháng lại kháng thể 1 từ chuột) với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lượng dung dịch cần pha và cách sử dụng tương tự bước 3.
Ủ mẫu trong 1 giờ ở 370 C.
Bước 6: Ủ với treptavidine-biotin HRP: Pha phức hợp streptavidine- biotinylated horseradise peroxidase với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lượng dung dịch cần pha và cách sử dụng tương tự bước 3.
Ủ mẫu trong 30 phút tại nhiệt độ phòng.
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần).
Bước 7: Làm hiển thị màu bằng DAB: Pha DAB trong Tris buffer pH 7,6 không có NaCl (0,5mg DAB/ml Tris buffer). Bổ sung ngay trước khi dùng H2O2 (30%) với tỉ lệ 3H2O2 : 5Tris buffer.
Nhúng lam mẫu vào dung dịch và ủ vài phút tại nhiệt độ phòng.
Kiểm tra sự hiện màu (màu nâu tích tụ trong tế bào nhiễm virus) trong phút đầu tiên sau khi nhúng lam vào dung dịch DAB. Dừng phản ứng bằng cách nhúng lam trong tris buffer pH 7,6 + NaCl.
Bước 8: Nhuộm tạo nền tương phản bằng cách nhúng lam vài lần vào dung dịch hematoxylin pha loãng.
Rửa cẩn thận với nước máy trong 1 phút. Bước 9: Khử nước Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 70% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 100% 1 lần 5 phút/lần. Xylene 1 – 2 lần 5 phút/lần. Bước 10: Dán lamel với Baume Canada.
Lam sau khi lấy ra khỏi xylene để khô trong vài phút, nhỏ một giọt keo Baume Canada ngay trên tiêu bản mẫu, đặt lamel lên lam kính, tránh hiện tượng có bọt khí bên trong.
Giai đoạn 3: Đọc kết quả. Cách đọc tiêu bản xác định thể ẩn và ghi nhận kết quả như
sau:
Xem kết quả bằng kính hiển vi quang học ở vật kính 10x, 40x, 100x. Tế bào nhiễm WSSV có thể vùi dạng Crowdry A đặc trưng với nhân trương to, sau đó hạch nhân trương to hơn, chiếm hết nhân, bắt màu nâu.
Các kết quả được khảo sát dựa trên:
+ Tỷ lệ cảm nhiễm là số tôm bệnh trên tổng số tôm kiểm tra. + Cường độ cảm nhiễm là % tế bào nhiễm virus.
+ Cường độ bắt màu là % tế bào nhiễm bắt màu nâu (vì ngoài màu nâu, tế bào nhiễm còn có thể bắt màu nâu nhạt hay vàng). + Độ sắc nét là % tế bào nhiễm bắt màu sắc nét.
Kết quả xét nghiệm được mã hoá thành kí hiệu và giá trị có ý nghĩa về mặt toán học (Bảng 3.1).
Bảng 3.5. Bảng mã hoá kết quả
Nội dung Số liệu Cường độ Kí hiệu mã hoá cảm nhiễm
- 0 0% 0% 0% +/- 1 0 - 25% 0 - 25% 0 - 25% + 2 25 - 50% 25 - 50% 25 - 50% ++ 3 50 - 75% 50 - 75% 50 - 75% +++ 4 75 - 100% 75 - 100% 75 - 100% Cường độ bắt màu Độ sắc nét
Sau khi đọc kết quả, các lam chứa mẫu và các thông số đều được lưu lại. Trong suốt quá trình thực hiện cần đánh dấu mẫu cẩn thận để tránh nhầm lẫn