Bảng 2.1. Một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt Nam (Đỗ Tấn Dũng, 1996)
STT Tên bệnh Phân loại
1 Héo vàng cây khoai lang Fusarium batatas
2 Mốc hồng ngô F.moniliform f.sp. maydis
3 Lở gốc đậu tƣơng F.oxysporum f.sp. glysines
4 Héo vàng cây dƣa chuột F.solani f.sp.cucumerium
5 Héo vàng cây gừng F.oxysporum f.sp.zinggeberi
6 Vết xám trên cỏ lồng vực Fusarium sp.
7 Héo vàng cây hoa loa kèn F.oxysporum f.sp.lini
8 Vết xám trên cành chanh F.semitectum Berk
9 Thối củ chuối F.oxysporum f.sp.cubense
10 Héo vàng cây đinh lăng F.oxysporum f.sp.medicagins
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu thí nghiệm
3.1.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Đề tài đƣợc tiến hành từ 20/03/2007 đến 30/07/2007
Địa điểm nghiên cứu
Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông học trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
- Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và công nghệ môi trƣờng trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.1.2. Vật liệu
Chủng vi sinh vật
Các dòng nấm Fusarium spp.gây hại xƣơng rồng.
Môi trƣờng Môi trƣờng WA
Agar 15 g H2O 1.000 ml
Môi trƣờng PGA
Khoai tây 200 g Glucose 20 g Agar 15 g H2O 1.000 ml
Môi trƣờng nhân sinh khối
Glucose 20 g Yeast extract 5 g MgSO4.7H2O 0,5 g KH2PO4 0,5 g
K2HPO4 0,5 g CaCl2 1ít H2O 1.000 ml
Các thiết bị, dụng cụ thƣờng sử dụng
Các thiết bị
Máy điện di (Bio-Rad) Bộ chày cối để nghiền mẫu Máy Vortex
Máy PCR
Máy chụp gel (Gel Doc 2000) Tủ cấy vi sinh
Máy phơi mẫu 37ºC Máy ủ mẫu
Tủ giữ mẫu: tủ lạnh (– 70ºC, – 20ºC), tủ mát (– 4ºC). Lò Viba
Máy li tâm (Sigma)
Dụng cụ Ống nghiệm Micropipette các loại Đầu típ các loại Eppendorf các loại Các hóa chất sử dụng
Các hóa chất để li trích DNA sợi nấm
TE 1X
Nitơ lỏng (nghiền mẫu nấm)
Phenol/ Chlorform/ Isoamyl alcohol (25: 24: 1) Lysis Buffer
Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1) Isopropanol lạnh
Hóa chất sử dụng trong điện di
Gel agarose dùng để phân tích DNA qua điện di thƣờng dùng có nồng độ 1% agarose.
Dung dịch đệm TAE 0,5X dùng để pha gel và chạy điện di với các thành phần sau:
+ Tris HCl 4,48 g
+ Na 2 EDTA 0,5M (pH 8,0) 2 ml + Glacial acetic acid 1,14 ml + Nƣớc cất vừa đủ 1l ít Dung dịch nhuộm trên gel: 1% ethidium bromide
Hóa chất để thực hiện phản ứng PCR
– Buffer 5X – MgCl2 25mM – dNTP 25mM
– Primer ef1 10pmol/ l và primer ef2 1mpmol/ l – Taq DNA Polymerase 5U/ l
– H2O cất khử ion
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chết trên cây xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh
Tiến hành điều tra tình hình bệnh hại trên cây xƣơng rồng tại một số hộ trồng xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh từ đó xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra.
Hình thức điều tra: phỏng vấn, trao đổi trực tiếp với từng hộ sản xuất. 3.2.2. Phân lập mẫu nấm
Mẫu bệnh đƣợc thu thập tại các vƣờn xƣơng rồng bệnh ở Tp.Hồ Chí Minh. Tiến hành phân lập mẫu trên môi trƣờng WA và PGA.
Có 2 cách phân lập nấm từ xƣơng rồng bệnh
Cách 1: Mẫu bệnh đƣợc phân lập từ vết bệnh điển hình. Rửa mẫu bệnh bằng
nƣớc sạch vì xƣơng rồng đƣợc trồng dƣới đất nên lúc thu thập mẫu dính rất nhiều đất. Để khô mẫu, sau đó cắt bỏ phần gai bên ngoài lấy phần thịt bên trong gồm phần mô bệnh và phần mô khỏe, cắt lấy mảnh nhỏ có kích thƣớc 5 7 mm x 5 7 mm. Tiến hành rửa khử trùng mẫu bằng nƣớc cất vô trùng 1 2 lần rồi khử trùng mẫu bệnh bằng cồn 70º trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 2 3 lần, cắt nhỏ mẫu và để khô tự nhiên trong tủ cấy. Chú ý tất cả dụng cụ để cắt mẫu và khử trùng mẫu nhƣ cốc, dao, giấy thấm… đều phải vô trùng và không nên để mẫu quá khô. Sau đó đặt mẫu lên đĩa petri chứa sẵn môi trƣờng WA và đặt ở 5 7 điểm khác nhau trên đĩa, để ở nhiệt độ phòng. Khi nấm mọc cấy sang môi trƣờng WA một lần nữa bằng cách cắt lấy mẫu nấm mọc từ các mẫu bệnh ở các điểm khác nhau trên đĩa WA trƣớc cấy sang các điểm khác nhau trên đĩa. Lần này khi nấm mọc cấy chuyền sang đĩa có sẵn môi trƣờng PGA, sau đó nấm mọc lại cấy chuyền qua môi trƣờng PGA để tạo dòng thuần.
Cách 2: Mẫu bệnh sau khi đem về tiến hành rửa bằng nƣớc sạch, để khô. Tiến hành ủ mẫu: Chuẩn bị các hộp nhựa có kích thƣớc 20 x 8 cm đã
đƣợc khử trùng bằng cồn 70º, lót giấy thấm vô trùng dƣới đáy hộp, xếp ống hút nhựa thành hình tam giác rồi đặt trên miếng giấy thấm trong hộp, cho một ít nƣớc cất vô trùng vô hộp sao cho chỉ vừa ƣớt giấy là đƣợc để tạo độ ẩm. Cho mẫu bệnh vào hộp và tiến hành ủ mẫu cho đến khi nấm mọc. Vì không biết nấm mọc là nấm mong muốn hay không nên phải xem chúng trên kính hiển vi.
Xem nấm trên kính hiển vi: Dùng que cấy điểm khều lấy nấm trên
mẫu bệnh sau khi ủ cho lên miếng lame đã có sẵn một giọt nƣớc xem kính, rồi cho miếng lamelle đậy lên giọt nƣớc trên lame. Sau đó đƣa lên kính hiển vi để xem. Nếu nấm thuộc Fusarium spp.thì tiến hành phân lập.
Cách phân lập: Chuẩn bị lame, que trang, ống hút thủy tinh đã đƣợc
hấp khử trùng. Môi trƣờng WA sau khi hấp khử trùng, dùng ống hút thủy tinh đã chuẩn bị hút môi trƣờng WA cho lên lame sau đó trang đều bằng que trang. Chú ý môi trƣờng trên lame không quá dày và cũng không quá mỏng (vì nếu quá dày sẽ khó cắt bào tử và quá mỏng sẽ dễ bị khô môi trƣờng không cắt đƣợc bào tử). Chờ cho môi trƣờng trên lame khô tiến hành cho nấm lên lame bằng cách nhỏ một giọt nƣớc vô trùng trên lame có môi trƣờng, dùng que cấy khều nấm cho vào giọt nƣớc rồi dùng que trang vô trùng trải đều nấm trên lame. Chú ý miếng lame đƣợc đặt trong đĩa petri vô trùng có sẵn giấy thấm và ống hút xếp hình tam giác để tạo độ ẩm. Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 6 giờ, sau đó lấy miếng lame đƣa lên kính hiển vi để tiến hành cắt đơn bào tử (thƣờng cắt ở vật kính 4X). Dụng cụ để cắt đơn bào tử là dao cắt thạch trong phòng thí nghiệm. Bào tử sau khi đƣợc cắt xong đƣa qua môi truờng WA, mỗi đĩa chứa một đơn bào tử. Khi nấm mọc cấy sang môi trƣờng PGA vài lần để tạo dòng thuần.
Cách đặt tên mẫu: FC07 1 là mẫu nấm đƣợc phân lập từ mẫu bệnh trên
cây xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh năm 2007, mẫu 1 (F: Fusarium spp., C:
Cactaceae).
Sau đó chúng tôi tiến hành kiểm tra nấm thuộc các dòng Fusarium spp.bằng cách coi hình thái nấm mọc và màu sắc nấm trên môi trƣờng PGA. Nấm Fusarium
spp.mọc không gợn sóng và có màu trắng trên môi trƣờng.
3.2.3. Tăng sinh khối nấm trên môi trƣờng nhân sinh khối
Dùng que cấy tam giác cắt khoảng 3 miếng thạch mỗi miếng có kích thƣớc từ 2 3 mm có chứa nấm cho vào bình tam giác có sẵn 100 ml môi trƣờng nhân sinh khối đã hấp tiệt trùng. Nấm trong các bình tam giác đƣợc nuôi lắc trên máy lắc. Chú ý mỗi dòng nấm đƣợc nuôi trong một bình tam giác khác nhau. Sau 72 giờ tăng sinh, sinh khối nấm đƣợc thu hoạch bằng miếng vải đã đƣợc hấp khử trùng. Nấm
sau khi thu hoạch trên miếng vải chuyển qua miếng giấy bạc và đem tồn trữ mẫu ở tủ 70ºC cho đến khi tiến hành ly trích.
3.2.4. Ly trích DNA tổng số của nấm
Quy trình này đƣợc thực hiện dựa trên quy trình của Lee và Taylor.
Bƣớc 1: Nghiền mẫu nấm trong dung dịch nitơ lỏng. Mẫu nấm đƣợc nghiền
mịn cho vào các ống nghiệm có thể tích 15 ml. Trong quá trình nghiền cho nitơ lỏng vào liên tục để mẫu nấm không bị tan.
Bứơc 2: Thêm 4 ml lysis buffer vào trong ống nghiệm. Trộn đều, ủ ấm ở 65ºC trong
vòng 1 giờ.
Bƣớc 3: Thêm vào 3 ml phenol/chloroform/isoamylalcohol lần lƣợt theo tỷ lệ (25:
24: 1). Lắc đều, nhẹ. Ly tâm 10 phút với tốc độ 3000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.
Bƣớc 4: Hút lấy phần dịch nổi ở trên (3 – 5 ml) cho vào ống nghiệm có dung tích
15 ml khác.
Bƣớc 5: Thêm vào ống nghiệm mới 3 ml chloroform/isoamylalcohol (24: 1). Trộn
đều, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút.
Bƣớc 6: Hút lấy phần dịch nổi ở trên (3 – 5 ml) cho vào ống nghiệm có dung tích
15 ml khác.
Bƣớc 7: Thêm vào isopropanol lƣợng chất : 0,6 tổng thể tích của ống nghiệm. Lắc
nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 5 – 10 phút, ly tâm.
Bƣớc 8: Dùng que thu DNA tủa ở đáy ống.
Bƣớc 9: Dùng ethanol 70% để rửa tủa DNA. Rửa lại nhiều lần thƣờng là 3 – 4 lần. Bƣớc 10: Phơi khô mẫu. Mẫu DNA khô, thêm vào 200 l TE 1X.
3.2.5. Điện di xem DNA tổng số
Điện di ở bƣớc này nhằm mục đích xem sản phẩm li trích DNA có bị gãy hay không và sản phảm có tinh sạch không. Nếu sản phẩm không tinh sạch phải tiến hành tinh sạch lại một lần nữa.
Các bƣớc của quá trình điện di
Bƣớc 1: Chuẩn bị gel cho quá trình điện di. Cách chuẩn bị gel nhƣ sau: cân 0,125 g
agarose, thêm 12,5 ml TAE 0,5X, đun trong lò viba ở bƣớc sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thƣờng đun trong 2 phút). Để nguội đến khoảng 600C (đến khi nào cầm đƣợc mà không quá nóng) đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lƣợc đã cân bằng. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lƣợc ra khỏi gel và cho vào bồn điện di có chứa TAE 0,5X sẵn sàng cho việc đặt mẫu.
Bƣớc 2: Tiến hành điện di. Trộn dung dịch gồm 4 l DNA sau ly trích và 2 l
loading dye 6X. Cho dung dịch này vào giếng trên gel. Điện di 20 phút với cƣờng độ dòng điện là 400 mA và hiệu điện thế là 100V.
Bƣớc 3: Nhuộm mẫu. Sau khi điện di xong, gel đƣợc lấy ra khỏi bồn điện di và
ngâm vào dung dịch EtBr trong khoảng 15 20 phút.
Bƣớc 4: Quan sát kết quả điện di. Kết quả điện di đƣợc quan sát dƣới tia UV nhờ
vào máy chụp ảnh Gel Doc, đƣợc quan sát nhờ phần mềm Quantity one (Biorad) Sau khi quan sát kết quả điện di thấy sản phẩm ly trích chƣa sạch còn có nhiều tạp chất. Để sản phẩm sau khi thực hiện phản ứng PCR thật tinh sạch, có thể tiến hành tinh sạch lại sản phẩm ly trích DNA.
3.2.6. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng tef các dòng nấm
Fusarium spp.
Phản ứng PCR với cặp primer ef1và ef2. (David M. Geiser, 2004).
Thành phần phản ứng
Primer:
Bảng 3.1. Primer dùng trong phản ứng PCR
Primer Trình tự Primer theo chiều 5`- 3`
Ef1 ATTGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC Ef2 GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT
Thành phần phản ứng PCR và lƣợng cần dùng đủ cho một phản ứng: Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR và lƣợng dùng đủ cho một phản ứng Thành phần Liều lƣợng ( l) Nồng độ cuối PCR buffer 10X 10 5X MgCl2 3 1,5 mM dNTP 0,4 0,2 mM Primer 1 1 10 pmol/ l Primer 2 1 10 pmol/ l Khuôn DNA 1 20 ng/ l
Taq polymerase 0,2 5U/ l Nƣớc cất 33,4
Tổng cộng 50
Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR
Phản ứng với cặp primer ef1 và ef2.
Các giai đoạn trong phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo David M. Geiser và cộng sự, (2004).
Giai đoạn 1: 95ºC trong 3 phút Giai đoạn 2:
Bƣớc 1: 95ºC trong 30 giây
Bƣớc 2: 53ºC trong 45 giây 30 chu kỳ Bƣớc 3: 72ºC trong 45 giây
Giai đoạn 3: 72ºC trong 7 phút Sản phẩm PCR đƣợc giữ ở 4ºC.
Các bƣớc đọc kết quả sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên agarose gel 1 %, dịch đệm TAE 0,5X.
Chạy điện di: 100 V, 250 mA, 20 phút.
Nhuộm gel bằng dung dịch EtBr trong vòng 15 phút.
Kết quả đƣợc ghi lại nhờ đọc tia UV và chụp ảnh bằng phần mềm Quality One của máy Gel Doc 2000 (Biorad).
Bảng tóm tắt quy trình khuếch đại vùng tef của các dòng Fusarium spp. bằng cách sử dụng primer ef1 và ef2.
3.2.7. Đọc trình tự sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR đƣợc đọc trình tự.
Nấm Fusarium spp. đƣợc phân lập từ xƣơng rồng bệnh
Cấy chuyền sang môi trƣờng PGA
Nhân sinh khối nấm trong môi trƣờng nhân sinh khối Phân lập trên môi trƣờng WA
Hoá chất: PCR Buffer 10X MgCl2 Primer ef2 Primer ef2 dNTP Taq polymerase DNA khuôn Nƣớc cất Thu sợi nấm Ly trích DNA Thực hiện phản ứng PCR Chu kỳ nhiệt: 95ºC/3 phút 95ºC/30 giây 53ºC/45 giây 72ºC/45 giây 72ºC/7 phút Nghiền sợi nấm
Các mẫu đƣợc đọc trình tự: FC07 3, FC07 7, FC07 10.
3.2.8. Chủng nấm lên cây xƣơng rồng
Xƣơng rồng sau khi mua từ nhà vƣờn về để một tháng theo dõi có bệnh xuất hiện hay không. Những cây không bệnh đƣợc cho là cây khỏe mạnh và dùng để chủng bệnh.
Thí nghiệm tiến hành chủng bệnh nầm lên xƣơng rồng với 12 dòng nấm phân lập đƣợc: FC07 1, FC07 2, FC07 3, FC07 4, FC07 5, FC07 6, FC07 7, FC07 8, FC07 9, FC07 10, FC07 11, FC07 12. Các mẫu xƣơng rồng không chủng nấm bệnh dùng làm đối chứng.
3.2.8.1. Tiến hành chủng bệnh trên xƣơng rồng
Vật liệu
Nấm đƣợc nuôi trên môi trƣờng nhân sinh khối. Cây xƣơng rồng khỏe mạnh.
Hộp nhựa có kích thƣớc 20 x 8 cm. Kim tiêm + xi lanh 3 ml/cc.
Phƣơng pháp
Nấm sau khi đƣợc nuôi trên môi trƣờng, dùng xilanh hút lấy phần dịch lỏng tiêm trực tiếp lên cây xƣơng rồng, mỗi cây tiêm khoảng 3 ml. Sau khi tiêm, dùng bao nilông vô trùng bao cây xƣơng rồng vừa chủng bệnh xong để tránh sự lây lan ra ngoài môi trƣờng. Xƣơng rồng sau khi chủng đƣợc để trong điều kiện nhiệt độ phòng.
3.2.8.2. Đánh giá kết quả
Theo dõi xem sau khi chủng bệnh nấm bao nhiêu ngày thì xƣơng rồng bị bệnh và mô tả triệu chứng. Sau đó, lấy mẫu xƣơng rồng bị bệnh phân lập lại và xác định tác nhân gây bệnh. Cách phân lập giống nhƣ cách phân lập ban đầu từ các mẫu bị bệnh ở vƣờn xƣơng rồng mang về. Khi nấm mọc quan sát và mô tả.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tình hình bệnh hại xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh
Xƣơng rồng cũng giống nhƣ các loại cây cảnh khác thƣờng xuyên bị sâu bệnh gây hại làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng bình thƣờng, năng suất, phẩm chất trong đó có màu sắc, độ tƣơi lâu bền làm giảm giá trị kinh tế, giá trị thẩm mỹ, giá trị hàng hóa và xuất khẩu trên thị trƣờng, thậm chí còn làm chết cây. Hiện nay, tình hình bệnh hại nhất là bệnh chết khô trên cây xƣơng rồng đã gây thiệt hại rất lớn cho những hộ trồng xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh. Do đó, việc tiến hành điều tra tình hình bệnh hại và xác định tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo vệ thực vật.
4.2. Các triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng
Qua điều tra cho thấy một số bệnh thƣờng xuất hiện trên xƣơng rồng với các triệu chứng nhƣ sau:
Hình 4.2. Xƣơng rồng với triệu chứng thối vàng và đen ở gốc
Hình 4.3. Xƣơng rồng với triệu chứng thối thân
Hình 4.4. Xƣơng rồng cắt dọc với triệu chứng thối từ lõi ra ngoài
Qua một số triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng chúng tôi thấy bệnh phân bố trên tất cả trên các phần của cây kể cả cây ghép và cây không ghép.
4.2.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007) (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007)
Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra
Vƣờnđiều tra Tổng số chậu Số chậu bệnh do vi khuẩn Số chậu bệnh do nấm Số chậu bệnh do virus 1 5.000 450 1.500 0 2 15.000 1.500 2.500 0 3 12.500 700 2.500 100 4 11.200 900 2.500 0 5 9.300 800 700 0 6 7.900 550 1.200 0 7 11.500 500 2.000 0