Theo dõi xem sau khi chủng bệnh nấm bao nhiêu ngày thì xƣơng rồng bị bệnh và mô tả triệu chứng. Sau đó, lấy mẫu xƣơng rồng bị bệnh phân lập lại và xác định tác nhân gây bệnh. Cách phân lập giống nhƣ cách phân lập ban đầu từ các mẫu bị bệnh ở vƣờn xƣơng rồng mang về. Khi nấm mọc quan sát và mô tả.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tình hình bệnh hại xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh
Xƣơng rồng cũng giống nhƣ các loại cây cảnh khác thƣờng xuyên bị sâu bệnh gây hại làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng bình thƣờng, năng suất, phẩm chất trong đó có màu sắc, độ tƣơi lâu bền làm giảm giá trị kinh tế, giá trị thẩm mỹ, giá trị hàng hóa và xuất khẩu trên thị trƣờng, thậm chí còn làm chết cây. Hiện nay, tình hình bệnh hại nhất là bệnh chết khô trên cây xƣơng rồng đã gây thiệt hại rất lớn cho những hộ trồng xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh. Do đó, việc tiến hành điều tra tình hình bệnh hại và xác định tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo vệ thực vật.
4.2. Các triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng
Qua điều tra cho thấy một số bệnh thƣờng xuất hiện trên xƣơng rồng với các triệu chứng nhƣ sau:
Hình 4.2. Xƣơng rồng với triệu chứng thối vàng và đen ở gốc
Hình 4.3. Xƣơng rồng với triệu chứng thối thân
Hình 4.4. Xƣơng rồng cắt dọc với triệu chứng thối từ lõi ra ngoài
Qua một số triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng chúng tôi thấy bệnh phân bố trên tất cả trên các phần của cây kể cả cây ghép và cây không ghép.
4.2.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007) (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007)
Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra
Vƣờnđiều tra Tổng số chậu Số chậu bệnh do vi khuẩn Số chậu bệnh do nấm Số chậu bệnh do virus 1 5.000 450 1.500 0 2 15.000 1.500 2.500 0 3 12.500 700 2.500 100 4 11.200 900 2.500 0 5 9.300 800 700 0 6 7.900 550 1.200 0 7 11.500 500 2.000 0 8 17.500 1.500 4.000 50 9 3.000 0 10 0 Tổng cộng 92.900 6.900 16.910 150
Qua bảng 4.1 cho thấy chúng tôi tiến hành điều tra 9 hộ trồng xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh với tổng số là 92.900 chậu trong đó số bệnh do vi khuẩn là 6900 chậu, do nấm là 16.910 chậu và do virus là 150 chậu. Điều này còn đƣợc thể hiện qua tỷ lệ phần trăm (%) nhƣ sau:
Qua đánh giá kết quả từ bảng 4.1, tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn: bệnh do vi khuẩn: 7,43%, bệnh do nấm: 18,2%, bệnh do virus: 0,16%. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 T ỷ lệ n h iễ m b ện h ( % ) Vi khuẩn Nấm Virus Tác nhân gây bệnh
Bệnh chết khô trên xƣơng rồng đang ảnh hƣởng rất nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn cho ngƣời trồng xƣơng rồng. Chúng tôi tiến hành điều tra 9 vƣờn xƣơng rồng và phần lớn các vƣờn này tập trung ở các quận Thủ Đức, quận 12, quận Gò Vấp và huyện Hóc Môn. Qua điều tra cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh do nấm gây ra cao hơn hẳn so với tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn và virus (bảng 4.1 và đồ thị 4.1), hầu nhƣ vƣờn nào cũng bị nhiễm bệnh và tỷ lệ nhiễm bệnh trong mỗi vƣờn khá cao, cụ thể là hộ ở quận 12 vƣờn chỉ có 5.000 chậu nhƣng có đến 30% bị bệnh. Điều này có thể do thời tiết thay đổi bất thƣờng, mƣa nhiều làm cho bệnh phát sinh và phát tán nhanh. Tuy nhiên cũng có nhiều nguyên nhân góp phần làm cho bệnh lây lan là các yếu tố tự nhiên và một phần do chính cách chăm sóc và kỹ thuật của ngƣời trồng xƣơng rồng. Họ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, chƣa có quy trình kỹ thuật hợp lý. Do đó, việc tìm cách phát hiện sớm bệnh trên xƣơng rồng để điều trị cũng nhƣ phòng chống là rất cần thiết.
4.3. Phân lập mẫu nấm
Kết quả điều tra cho thấy, bệnh do nấm gây ra có tỷ lệ cao hơn vi khuẩn và virus. Trƣớc tình hình đó chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu xƣơng rồng có triệu chứng bệnh do nấm gây ra và tiến hành phân lập trên 2 môi trƣờng là WA và PGA trong đó môi trƣờng WA dùng để loại tạp nhiễm vi khuẩn trong mẫu bệnh và là môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng nên thích hợp cho việc cắt đơn bào tử. Kết quả phân lập đƣợc 12 dòng nấm với 2 hình thái đặc trƣng trên môi trƣờng PGA (hình 4.5). Hình thái nấm khác nhau có thể do chúng gây bệnh chuyên biệt cho từng loại xƣơng rồng.
Hình 4.5. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bệnh trên môi trƣờng PGA
A1. Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn
B1. Khuẩn lạc nấm màu tím, tròn, tơ mịn
4.4. Kết quả ly trích thu DNA tổng số từ các dòng nấm Fusarium spp.
DNA là vật chất cơ bản trong nghiên cứu di truyền phân tử. Do đó chúng ta phải ly trích đƣợc DNA tách khỏi tế bào và các chất nhƣ RNA, protein,… Có nhiều phƣơng pháp ly trích DNA nhƣng mục đích cuối cùng là làm sao thu đƣợc lƣợng DNA đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Mặc dù giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn khá đơn giản nhƣng nó lại đóng vai trò vô cùng quan trọng.
Chúng tôi đã tiến hành ly trích tất cả các dòng nấm phân lập đƣợc bao gồm: FC07 1, FC07 2, FC07 3, FC07 4, FC07 5, FC07 6, FC07 7, FC07 8, FC07 9, FC07 10, FC07 11, FC07 12. Sau khi ly trích xong, chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V/15 phút trong dung dịch TAE 0,5X, 4 l mẫu/giếng để kiểm tra DNA tổng số. Kết quả ly trích đƣợc thể hiện ở (hình 4.6). A1 B1 Hì nh 4.9 . Xƣ ơn g rồ ng với tri ệu ch ứn g th ối sa u kh i ch ủn g
Hình 4.6. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của nấm
Qua (hình 4.6) cho thấy 1. FC07 1, 2. FC07 2, 3. FC07 3,4. FC07 4, 5. FC07 5, 6. FC07 6, 7. FC07 7, 8. FC07 8, 9. FC07 9,10. FC07 10, 11. FC07 11, 12. FC07 12.
Kết quả ly trích DNA tổng số không tinh sạch hoàn toàn. Ngoài DNA tổng số còn có thêm phần tạp nhiễm và những đoạn DNA bị đứt gãy mà quá trình ly trích không thể loại bỏ đƣợc.
Nguyên nhân tạo ra những đoạn DNA đứt gãy
Quá trình nghiền chƣa tốt hoặc do hoá chất nhƣ phenol, chloroform.
Thời gian cho phenol để phá huỷ lớp vỏ, lớp màng nhân, loại bỏ protein. Nếu nhƣ thời gian quá dài sẽ gây nên sự đứt gãy DNA một lƣợng rất đáng kể.
Ly tâm (tốc độ, thời gian, thao tác):
- Ly tâm với thời gian ngắn, tốc độ thấp thì sự phân lớp chƣa tốt giữa phần dịch chứa DNA, lớp xác tế bào, lớp phenol.
- Ly tâm với thời gian quá dài thì phenol phá huỷ nhiều DNA hơn gây ra nhiều đoạn đứt gãy.
- Ly tâm với tốc độ quá cao và thời gian dài thì DNA sẽ bị gãy rất nhiều.
Nguyên nhân thu lƣợng DNA tổng số ít là do: - Mẫu nghiền chƣa mịn.
- Thời gian và nhiệt độ ủ chƣa đủ để phá vỡ vách tế bào. phần tạp DNA tổng số 1 2 3 4 5 6 8 6 6 7 8 9 10 11 12
- Sự phân lớp chƣa tốt ở các bƣớc ly tâm.
Thực hiện càng nhiều bƣớc ly tâm thì lƣợng DNA đứt gãy càng nhiều cho nên bƣớc tủa DNA không cần phải ly tâm để tập trung lƣợng DNA mà để lắng khoảng 30 phút sẽ thu đƣợc DNA tinh hơn.
Nhƣ vậy mức độ DNA tinh sạch có hoặc không có bị đứt gãy, lƣợng DNA tổng số thu đƣợc nhiều hay ít là do quá trình nghiền nấm và ly trích.
Có 9 dòng Fusarium spp.đƣợc sử dụng để chạy PCR.
4.5. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng tef
Hình 4.7. Sản phẩm PCR khi khuếch đại bằng cặp primer ef1 và ef2
Chúng tôi đã tiến hành khuếch đại 9 trong 12 dòng phân lập đƣợc gồm:
FC07 1, FC07 2, FC07 3, FC07 4, FC07 7, FC07 9, FC07 10, FC07 11, FC07 12. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V/20 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4 l mẫu/giếng.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, dựa vào thang ladder, cho thấy các dòng nấm Fusarium spp. chạy với primer ef1 và ef2 có kích thƣớc khoảng 700 bp.
4.6. Kết quả giải trình tự vùng tef
Các dòng nấm sau khi giải trình tự cho kết quả : FC07 3, FC07 7, FC07 10. Trình tự vùng tef của các dòng nấm đọc trình tự đƣợc đối chiếu với dữ liệu của chúng trên NCBI.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
So sánh vùng trình tự tef của 3 dòng FC07 3, FC07 7, FC07 10 với nhau và giữa 3 dòng với các dòng trên genbank kết quả thể hiện nhƣ sau:
So sánh trình tự nucleotide vùng tef của 3 dòng nấm FC07 3, FC07 7, FC07 10 sử dụng phần mềm CLUSTAL.
Bảng 4.2. So sánh phần trăm (%) độ tƣơng đồng giữa dòng FC07 – 3, FC07 – 7 và FC07-10 Xác định phần trăm độ tƣơng đồng sử dụng phần mềm ClustalX (1.83) 1: FC07-3 100 100 72 2: FC07-10 100 100 72 3: FC07-7 72 72 100
Qua bảng so sánh 3 dòng nấm trên chúng tôi thấy độ tƣơng đồng giữa FC07 – 3 và FC07 – 10 là 100%, FC07 – 3 và FC07 – 7 là 72%. Nhƣ vậy, dòng FC07 – 3 và dòng FC07 – 10 cùng 1 loài nấm và sự sai khác về nucleotide giữa 2 dòng trên với dòng FC07 – 7 là 28%. Nhƣ vậy, sự sai khác này là khá lớn, có thể dòng FC07 – 7 khác với 2 dòng FC07 – 3 và FC07 – 10.
Để biết mức độ tƣơng đồng giữa 3 dòng nấm trên với các dòng trên genbank chúng tôi tiến hành so sánh trình tự vùng tef của 3dòng FC07 3, FC07 7, FC07 10 với các dòng trên genbank sử dụng phần mềm CLUSTAL.
Bảng 4.3. So sánh phần trăm (%) độ tƣơng đồng giữa 3 dòng FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10 với các dòng trên genbank
Xác định phần trăm độ tƣơng đồng sử dụng phần mềm ClustalX (1.83)
1: FC07-3 100 100 99 77 77 75 79 77 68 2: FC07-10 100 100 99 77 77 75 79 77 68 3: DQ465954-F.solani.south-Africa 99 99 100 78 78 75 80 78 67 4: AJ543556-F.culmorum.Nauy 77 77 78 100 98 90 83 83 73 5: AJ543580-F.graminearum.Nauy 77 77 78 98 100 89 83 82 72 6: EF512027-F.langsethiae.Canada 75 75 75 90 89 100 80 81 71 7: DQ295139-F.lateritium.China 79 79 80 83 83 80 100 80 68 8: DQ837692-F.oxysporum.China 77 77 78 83 82 81 80 100 71 9: FC07-7 68 68 67 73 72 71 68 71 100
Qua bảng so sánh độ tƣơng đồng vùng trình tự tef giữa 3 dòng FC07 3, FC07 7, FC07 10 với các dòng trên genbank khi sử dụng phần mềm CLUSTAL. Chúng tôi thấy dòng FC07 3, FC07 10 có độ tƣơng đồng với loài
Fusarium solani là cao nhất 99%. Nhƣ vậy, có thể khẳng định rằng dòng FC07 3, FC07 10 là Fusarium solani. Còn dòng FC07 – 7 có độ tƣơng đồng cao nhất so với các dòng trên genbank cũng chỉ 73%, quá thấp để khẳng định nó là loài nào.
Chúng tôi nghi ngờ nên đã Blast trình tự của dòng FC07-7 sau khi xử lý lên genbank nhƣng vẫn thu đƣợc độ tƣơng đồng rất thấp.
Nguyên nhân không thể khẳng định dòng FC07-7 là do:
Qua so sánh độ tƣơng đồng giữa dòng FC07-7 với một số dòng trên genbank chúng tôi nhận thấy đã khuếch đại đúng vùng chức năng, nhƣng không thể khẳng định tên dòng của FC07-7 do tác động của điều kiện sinh thái, địa lý sống khác
nhau hoặc do đột biến trong quá trình phân chia tế bào nên có sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen của dòng trong cùng 1 loài.
Có thể dòng FC07 – 7 chƣa đƣợc nghiên cứu vùng chức năng tef trên genbank nên chúng tôi không thể so sánh đƣợc.
Vậy, nấm gây bệnh thối trên xƣơng rồng ngoài Fusarium solani còn có loài nấm khác còn đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu.
Qua đó chúng tôi thấy định danh bằng hình thái không chính xác vì môi trƣờng sống của các giống loài ở những điều kiện khác nhau thì hình thái cũng có sự thay đổi dần để thích nghi, tồn tại và phát triển. Cho nên, định danh phân tử hiệu quả hơn, chính xác hơn. Công cụ trong sinh học phân tử nhƣ: kỹ thuật khuếch đại các vùng bảo tồn giống loài và những vùng chức năng khác, các probe đánh dấu và giải trình tự khuếch đại cung cấp những thông tin chính xác hơn về giống loài.
Kết quả giải trình tự vùng tef của 3 dòng FC07 3, FC07 7, FC07 10
Kết quả giải trình tự của dòng FC07-3
TCGACTCTGGCAAGTCGACCACCGTAAGTCAAACCCTCATCGCGATCTGCTTATCTCGGGTCGTGGAACCCCGCCTGGCA TCTCGGGCGGGGTATTCATCAGCACTTCATGCTGACAATCATCTACAGACCGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTATC GACAAGCGAACCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTTGGTGACATCTCCCCCGATCGCGCCTTGCTATTCCACAACGAATTCCC TCCCTCGCGATACGCTCTGCGCCCGCTTCTCCCGAGTCCCAAAATTTTTGCGGTCCGACCGTAATTTTTTTGGTGGGGCATT TACCCCGCCACTCGGGCGACGTTGGACAAAGCCCTGATCCCTGCACACAAAAACACCAAACCCTCTTGGCGCGCATCAT CACGTGGTTCACAACAGACGCTAACCGGTCCAACAATAGGAAGCCGCTGAGCTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTACGCCTG GGTCCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCCGCT ACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTGCTGTCACCTCTGTCACACACGTCTCACCACTAACAATCAACAGACGCC
Kết quả giải trình tự của dòng FC07-7
TCGACTCCGGAAAGTCCACCACTGTAAGTTCTCACTCCATGACTGTTTACAATCAGTCTTACCCCGCCATTTTATCTGGTG GGAGTCCCTGCAACAGTATACTGACATTTACAACTAGACCGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTATCGACAAGCGAA CCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAGGTCACTTTTCCCTCGATTCCTGAGCCTTTCCCTACGCGATCGATTCGCTTCACGTCC ATCACCCCGCCCAACATCGATGATATTTTTTTTGCGTGGCTTTTTTATATTGGTGGGGGGTTTTACCCCGCCGAATATGAG AAGCTGGCATTTCGCCCCACCACAAAAATTTTCATCCTTTCTCATGGCTCGTCACAAGCAATCAAGACATGATGCTGACA ACCCACCAATAGGAAGCCGCCGAGCTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTACGCCTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCG TGAGCGTGGTATCACCATCGATATCGCTCTCTGGAAGTTCGAGACTCCTCGCTACTATGTCACCGTCATTGGTAAGTTTTG ATTGACTCATGCATGTCATCATCTATCAGTCACTAACATACATGATAGACGCC
Kết quả giải trình tự của dòng FC07-10
TCGACTCTGGCAAGTCGACCACCGTAAGTCAAACCCTCATCGCGATCTGCTTATCTCGGGTCGTGGAACCCCGCCTGGCA TCTCGGGCGGGGTATTCATCAGTCACTTCATGCTGACAATCATCTACAGACCGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTAT CGACAAGCGAACCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTTGGTGACATCTCCCCCGATCGCGCCTTGCTATTCCACAACGAATTCC CTCCCTCGCGATACGCTCTGCGCCCGCTTCTCCCGAGTCCCAAAATTTTTGCGGTCCGACCGTAATTTTTTTGGTGGGGCA TTTACCCCGCCACTCGGGCGACGTTGGACAAAGCCCTGATCCCTGCACACAAAAACACCAAACCCTCTTGGCGCGCATCA
TCACGTGGTTCACAACAGACGCTAACCGGTCCAACAATAGGAAGCCGCTGAGCTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTACGCCT GGGTCCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCCGT ACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTGCTGTCACCTCTGTCACACACGTCTCACCACTAACAATCAACAGACGCC
4.7. Chủng bệnh trên xƣơng rồng
Chúng tôi tiến hành chủng lên cây xƣơng rồng khỏe.
Hình 4.8. Xƣơng rồng khỏe mạnh trƣớc khi chủng bệnh
Hì nh
Sau 4 ngày chủng, quan sát thấy 7 dòng nấm có khả năng gây hại mạnh: FC07 1, FC07 3, FC07 4, FC07 6, FC07 7, FC07 – 8, FC07 10 với các triệu chứng nhƣ (hình 4.9). Các dòng còn lại có khả năng gây bệnh yếu. Điều này có thể do phân lập, cấy chuyền nhiều lần nên độc tính của nấm bị giảm hoặc do đặc tính giống xƣơng rồng có tính chống chịu với mầm bệnh.
Sau đó chúng tôi tiến hành phân lập lại từ các cây xƣơng rồng chủng bệnh có biểu hiện bệnh. Kết quả thu đƣợc nấm có hình thái, màu sắc khuẩn lạc giống với ban đầu (hình 4.10)
Hình 4.10. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bị bệnh sau khi chủng nấm 4 ngày trên môi trƣờng PGA
Nhƣ vậy, sau khi chủng các dòng FC07 1, FC07 2, FC07 3, FC07 4, FC07 5, FC07 6, FC07 7, FC07 8, FC07 9, FC07 10, FC07 11, FC07 12, chúng tôi đã phân lập lại đƣợc tất cả các dòng. Qua (hình 4.10) là các dòng FC07 –3
Chƣơng 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Qua kết quả điều tra cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh do nấm gây ra cao hơn hẳn (18,2%) so với tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn (7,43%) và virus (0,16%).
Phân lập các dòng nấm thuộc Fusarium spp. trên xƣơng rồng bệnh qua 2 môi trƣờng WA và PGA. Kết quả phân lập đƣợc 12 dòng nấm với 2 hình thái đặc trƣng:
Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn.
Khuẩn lạc nấm màu tím, tròn, tơ mịn.
Tiến hành nhân và thu sinh khối các dòng nấm cần cho mục đích ly trích các dòng nấm để khuếch đại vùng gen tef với cặp primer ef1 và ef2 và thu đƣợc sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc 700 bp (căn cứ trên thang ladder), phản ứng thực hiện trên 9 trong 12 dòng ly trích đƣợc.
Tiến hành giải trình tự vùng tef trên 3 dòng nấm FC07 3, FC07 7, FC07 10. Kết quả giải trình tự định danh dòng FC07 3 và FC07 10 là Fusarium solani, còn dòng FC07 – 7 vẫn đang tiếp tục nghiên cứu.
Sau khi chủng bệnh nấm lên xƣơng rồng khỏe mạnh thu đƣợc kết quả: 7 dòng nấm có khả năng gây bệnh nặng. Các dòng còn lại có khả năng gây bệnh yếu. Mẫu nấm sau khi phân lập lại có hình thái giống với lần phân lập trên xƣơng rồng bệnh từ các vƣờn.
5.2. Đề nghị
Từ những khó khăn, trở ngại trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi có thể đƣa ra một số đề nghị sau:
Cần có những nghiên cứu cụ thể hơn về đặc điểm sinh trƣởng và phát triển, hình thái cụ thể của từng dòng nấm để góp phần cho kết quả định danh chính xác hơn.
Tiếp tục nghiên cứu các loài nấm gây hại trên xƣơng rồng để từ đó có những