2.4.2.1. Sử dụng cây giống kháng bệnh
Theo Bùi Xuân Đồng (1986), khi trồng phải xem xét điều kiện sinh thái đất đai mà chọn các giống thích hợp cho từng điều kiện của vùng và cần xem xét thƣờng xuyên về những thay đổi tính chống chịu của giống.
2.4.2.2. Biện pháp canh tác
Theo Bùi Xuân Đồng (1986), biện pháp này rất quan trọng để phòng trừ nấm
Fusarium. Trƣớc khi trồng phải làm đất kỹ, xử lý đất, bón phân hợp lý, luôn vệ sinh vƣờn sạch, thoáng mát. Nếu phát hiện bệnh phải thu gom các bộ phận bị bệnh đi tiêu hủy tránh sự lây lan trong vƣờn, chăm sóc kỹ cho từng giai đoạn sinh trƣởng của cây. Cần ngăn chặn di chuyển những cây bị bệnh từ vùng này sang vùng khác
tránh đƣợc mầm bệnh ban đầu. Khi cây bị bệnh có thể đào bỏ, xử lý đất bằng vôi hay một số loại thuốc trừ nấm khác.
2.4.2.3. Biện pháp hóa học
Theo Bùi Xuân Đồng (1986), trên một số cây trồng có thể sử dụng một số thuốc hóa học trừ nấm khi cây bị nhiễm bệnh nhƣ: Metazeb, Benomyl, Rovral, Ridomil, Copper và một số thuốc khác, liều dùng nhƣ khuyến cáo. Sử dụng thuốc trên bằng cách phun hoặc tƣới vào gốc cây bị bệnh một vài lần cách nhau 7 – 10 ngày.
2.5. Tổng quan về vùng tef trên genome của nấm Fusarium
Hình 2.2. Bản đồ vùng gen tef trên nấm Fusarium sử dụng trong FUSARIUM- ID
Theo David M. Geiser và cộng sự (2004), gen tef giải mã một số protein thiết yếu cho bộ máy dịch mã, có tính hữu ích cao trong nghiên cứu sự phát sinh loài vì nó mang thông tin cao ở mức độ loài của Fusarium. Gen này lần đầu tiên đƣợc sử dụng nhƣ một marker trong nghiên cứu phát sinh loài để suy ra mối tƣơng quan và mức độ di truyền giữa các loài (Cho và ctv, 1995; Mitchell và ctv, 1997). Primer lần đầu tiên đƣợc phát triển trên nấm để khám phá và kiểm tra chuỗi thế hệ của các dòng Fusarium oxysporum (O` Donnell và ctv., 1998). Primer ef1 và ef2 đƣợc thiết kế dựa trên một phần vị trí exons giữa Trichoderma reesei và Histoplasma capsulatum. Các primer này có thể khuếch đại vùng 700 bp của gen tef flanking với 3 intron mà tổng số hơn nữa chiều dài của đơn vị siêu sao chép trong tất cả các loài đã biết (hình 2.2). Gen này xuất hiện phù hợp với số lƣợng copy đơn trên nấm
Fusariium, và nó thể hiện mức độ cao của các trình tự đa hình giữa các loài có quan hệ mật thiết, ngay cả trong so sánh các phần của gen giải mã protein nhƣ là
calmodulin, beta-tubulin và histon H3. Vì các lý do đó, tef đã trở thành marker chọn lọc nhƣ là công cụ xác định single - locus trên nấm Fusarium.
Ngoài nấm Fusarium thì trên các loại nấm khác chẳng hạn nhƣ nấm
Trichoderma cũng có vùng tef. Trên nấm này vùng tef cho kết quả chính xác hơn là dựa vào vùng rDNA-ITS vì các loài vẫn có sự tƣơng đồng về trình tự trong vùng rDNA-ITS. Tef hữu ích trong việc xác định vùng gen chuyên biệt nhƣ vùng gen mã hoá actin, calmodulin, endochitinase, nó còn cho phép phân biệt đƣợc giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Trong phòng thí nghiệm, vùng tef đƣợc quan tâm và khuếch đại đoạn gene có kích thƣớc khoảng 600 bp (Gary J. Semuels). (trích dẫn bởi Lại Hà Tố Hoa, 2006).
Một nhóm nghiên cứu gồm Bogale, Mesfin và ctv (2007), đã sử dụng trình tự gen tef để thiết kế primer chuyên biệt cho các loài Fusarium redolens và trong kỹ thuật PCR- RFLP để phân biệt giữa 3 loài Fusarium oxysporum cùng một tổ tiên chung. Gần đây hình thái học và các kỹ thuật chẩn đoán phân tử về nấm Fusarium redolens và 3 dòng Fusarium oxysporum phát sinh loài từ một tổ tiên chung còn mơ hồ. Do đó trình tự gen tef từ những loài này và các loài có mối quan hệ mật thiết với chúng đƣợc sử dụng để thiết kế primer chuyên biệt cho loài F. redolens, và để xác định vị trí giới hạn phân biệt giữa 3 loài F. oxysporum có chung một tổ tiên.
2.6. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nấm
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) đƣợc mô tả bởi Kary Mullis và các cộng sự (1985).
2.6.1. Khái niệm
Đây là phƣơng pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA cần đƣợc khuếch đại.
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những primer chuyên biệt.
Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của bộ gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho từng loại vi sinh vật mục tiêu hoặc gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật.
Primer là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung vào đầu 3’ của khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài primer để hình thành mạch mới (Bùi Trang Việt, 2002).
2.6.2. Nguyên tắc
Sự khuếch đại đƣợc thực hiện nhờ chu trình nhiệt lặp lại.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: (giai đoạn biến tính: tách sợi đơn DNA, denaturation) Ở điều kiện
nhiệt độ cao phân tử DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn và nhiệt độ cần thiết để biến tính hoàn toàn DNA thƣờng là 94 – 950C trong 30 – 60 giây.
Giai đoạn 2: (giai đoạn bắt cặp giữa primer và khuôn, anealation) Khi nhiệt độ hạ
xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy Tm của primer, primer sẽ bắt cặp với mạch khuôn tại vị trí có trình tự bổ sung với primer. Nhiệt độ cho giai đoạn này là 50 – 640C.
Giai đoạn 3: (giai đoạn tổng hợp, kéo dài, elongation) Nhiệt độ tăng lên 720
C, ở nhiệt độ này Taq DNA polymerase hoạt động tối ƣu. Trong khoảng 30 giây cho đến vài phút tùy theo kích thƣớc cần khuếch đại. Khi đó Taq DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới dựa trên trình tự của mạch khuôn, độ dài đoạn khuếch đại là khoảng cách giữa hai primer đơn đã bắt cặp với 2 DNA khuôn mạch đơn, các nucleotid lần lƣợt đƣợc gắn vào mỗi đầu DNA khuôn sợi đơn, gắn kế tiếp các nucleotid của primer và chiều bổ sung là 5’ ở trên cả 2 DNA sợi đơn. Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 giai đoạn nhƣ trên sẽ đƣợc lặp đi lặp lại nhiều chu kỳ và làm gia tăng số lƣợng DNA theo cấp số nhân. Sự khuếch đại này đƣợc tính nhƣ sau:
Trong đó:
n là số chu kỳ thực hiện.
m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra.
Yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR là nhiệt độ nóng chảy của primer Tm. Trong số 3 giai đoạn trên, giai đoạn 2 quan trọng nhất bởi vì trong giai đoạn này sự lai DNA – DNA giữa primer và khuôn xảy ra. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá thấp thì việc lai DNA sẽ bị nhiều lỗi. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá cao thì không lai đƣợc DNA. Vì thế để thiết lập nhiệt độ cho phản ứng PCR ngƣời ta xác định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm primer nhƣ sau:
Tm= 4 x (G+X) + 2(A+T)0C.
2.6.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR
DNA khuôn
DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch nhƣng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại DNA thu đƣợc trực tiếp từ dịch trích tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thƣờng phƣơng pháp này đƣợc áp dụng trong chẩn đoán. Lƣợng DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật nhỏ khoảng 1 g. Nếu lƣợng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn hay còn gọi là dƣơng tính giả.
Enzyme
DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao:
Taq polymerase đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus (vi khuẩn suối nƣớc nóng). Taq polymerase quá cao sẽ thấy hiện tƣợng tổng hợp DNA do phản ứng giả của primer trên dây đơn, đây là những kết quả không chuyên tính sẽ làm sai lệch kết quả, còn nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp sẽ không có đủ số lƣợng enzyme để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn.
Primer và nhiệt độ lai
Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau:
Trình tự primer đƣợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer “xuôi” và primer “ngƣợc”, không có những cấu trúc “primer dimer” do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một primer.
Nhiệt độ nóng chảy Tm của primer xuôi và primer ngƣợc không đƣợc cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng tránh lặp đi lặp lại nhiều lần.
Các primer phải đặt trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen.
Các thành phần khác trong phản ứng PCR
Bốn loại nucleotide (dNTP) thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ là 200 nM/mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sản phẩm khuếch đại dƣơng tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.
Nồng độ Mg2+ cao hay thấp đều tạo ra các ảnh hƣởng rất khác nhau trong phản ứng PCR.
Số lƣợng chu kỳ phản ứng
Số chu kỳ trong phản ứng thông thƣờng không đƣợc vƣợt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: sự phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ làm ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp không bắt cặp với mồi mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ cho một phản ứng còn phụ thuộc vào số lƣợng mẫu ban đầu.
Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR
Máy PCR cần đáp ứng đƣợc yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh, thật chính xác, tránh tối đa sự bốc hơi nƣớc trong quá trình thực hiện phản ứng PCR.
Eppendorf dùng cho phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt.
2.6.4. Ứng dụng của PCR
Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh: thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nƣớc, phát hiện pháp y, điều tra tội phạm. Ứng dụng PCR để sản xuất những mẫu dò dùng trong phƣơng pháp lai phân tử, xác định các trình tự acid nucleic, tạo các đột biến điểm định hƣớng.
Hơn thế nữa PCR còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhƣ:
Trong nghiên cứu genome học
Nhân bản vô tính với PCR. Recombinant PCR.
Kỹ thuật footprinting DnaseI. Multiplex PCR.
HLA DNA (các kháng nguyên bạch cầu ngƣời)
2.7. Giới thiệu sơ lƣợc về kỹ thuật DNA sequencing
Kỹ thuật DNA sequencing là công trình đƣợc công bố bởi Maxam và Gilbert (1977). Tuy nhiên hơn 20 năm qua kỹ thuật này đƣợc cải tiến rất nhiều. Đặc biệt với sự trợ giúp của computer, kỹ thuật huỳnh quang, tiến bộ của phƣơng pháp PCR và kỹ thuật điện di, kỹ thuật DNA sequencing trở thành công cụ rất có giá trị, làm nền tảng cho phân tích genome.
Khái niệm: Kỹ thuật DNA sequencing là kỹ thuật xác định tất cả những hợp phần do nucleotid hình thành nên phân tử DNA (Alphey, 1997).
2.8. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do nấm Fusarium spp. 2.8.1. Trên thế giới 2.8.1. Trên thế giới
Tuy hiện nay các kỹ thuật công nghệ sinh học rất phát triển nhƣng dƣờng nhƣ việc ứng dụng các kỹ thuật này để định danh hay chẩn đoán bệnh do nấm
Fusarium spp. gây hại trên xƣơng rồng rất ít. Và theo chúng tôi tìm hiểu thì chƣa thấy có tài liệu nào nói về kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện
nấm Fusarium spp. gây bệnh trên xƣơng rồng. Chỉ có chẩn đoán và phát hiện nấm
Fusarium spp. bằng biện pháp sinh học phân tử trong một số lĩnh vực nhƣ là:
Ralph A. Wang, Yi-Hong và cộng sự, (2002) đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện genotype kháng Fusarium gây bệnh héo trên cây trồng. Nghiên cứu này nhằm mục đích phát hiện genotype của cây họ bầu bí kháng hay mẫn cảm với sự nhiễm Fusarium. Các nhà nghiên cứu này đã sử dụng phƣơng pháp PCR để khuếch đại DNA mẫu, sử dụng cặp mồi AM hoặc FM. Sản phẩm PCR từ các cặp mồi khác nhau về kích cở, phụ thuộc vào DNA mẫu thu đƣợc từ cây mẫn cảm hay kháng nấm Fusarium, nghiên cứu đã xác định nhanh và chính xác kiểu gen của cây trồng.
Hirano, Yasushi và ctv (2006), đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phân biệt
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici và radicis-lycopersici và loài F. oxysporum
f. sp. lycopersici gây bệnh trên cây cà chua. Bằng cách so sánh một phần trình tự của gen mã hóa enzyme endopolygalacturonase (pg1) và enzyme exopolygalacturonase (pgx4) phân lập từ F. oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) và
radicis-lycopersici (FORL) ở Nhật Bản và thiết kế các primer chuyên biệt (uni, sp13, sp23, and sprl) trên các nucleotide khác nhau của các loài gây bệnh. PCR với primer uni khuếch đại đoạn gen dài 670 - 672 bp từ FOL và FORL. Với primer sp13, chỉ thu đƣợc từ loài FOL 1 và 3. Với primer sp23, đoạn gen 518 bp thu đƣợc từ loài FOL 2 và 3 đƣợc khuếch đại. Primer sprl cho sản phẩm khuếch đại dài 947 bp, từ loài FORL , nhƣng không cho sản phẩm ở loài FOL.
Yli - Mattila T., Paavenen S. và ctv (1996), đã sử dụng phƣơng pháp Isozyme và RAPD-PCR trong phân tích sự đa hình các dòng Fusarium avenceum ở Phần Lan. Kỹ thuật izozyme và RAPD - PCR đƣợc so sánh trong nghiên cứu đa hình giữa 33 dòng Fusarium avenaceum sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide và điện di trên gel agarose. Kỹ thuật isozyme đã phát hiện đƣợc 5 sự đa hình và độ tƣơng đồng là 70%, còn phƣơng pháp RAPD - PCR cho phép phân tích tất cả các dòng của F. avenaceum. Kết quả phenotype từ phân tích
RAPD - PCR đƣợc chia thành 5 nhóm chính bằng phân tích trung bình cộng và độ tƣơng đồng là 55%.
Chiocchetti Annalisa và ctv, (1999) đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện Fusarium oxysporum f. sp. basilici trên cây húng. Bằng cách sử dụng 69 trình tự DNA đƣợc khuếch đại, tạo ra từ sự phân lập các dòng Fusarium oxysporum f. sp.
basilici khác nhau, F. oxysporum f. sp. basilici đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp dot blot. Một trình tự dài 1038 bp đƣợc lai DNA từ tất cả các dòng F. oxysporum f. sp.
basilici nhƣng không thu đƣợc đoạn DNA từ các dòng F. oxysporum phân lập từ các cây húng không mang bệnh hoặc các dạng đặc biệt khác điển hình của
F. oxysporum, hoặc từ sự phân lập các loài F. redolens, F. tabacinum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, S. minor, và Pythium ultimum thu đƣợc từ các cây húng bị bệnh. Trình tự này đƣợc tạo dòng và đọc trình tự, 3 cặp mồi chuyên biệt của
F. oxysporum f. sp. basilici đƣợc thiết kế, lần lƣợt cho sản phẩm khuếch đại là 943, 382, và 330 bp. Kỹ thuật nested PCR cho phép phát hiện F. oxysporum f. sp.
basilici từ hạt bị bệnh và hạt bị nhiễm bẩn do tự nhiên hoặc nhân tạo.
R N Crowhurst và cộng sự (1991), đã phân biệt sự khác nhau giữa nấm
Fusarium solani f. sp. cucurbitae loài 1 và 2 bằng kỹ thuật RAPD. Phƣơng pháp này sử dụng để đánh giá sự đa dạng về genome giữa 21 dòng F. solani f. sp.
cucurbitae loài 1 và loài 2. 7 sản phẩm đa hình nhờ RAPD đã sử dụng probe trong lai Southern genomic DNA trong đó 6 của 7 probe trong lai phân tử đƣợc sao chép trong giải trình tự đơn và 5 của 7 probe biểu hiện một sự lai chuyên biệt.
Một nhóm nghiên cứu ngƣời Pháp (2000), đã sử dụng probe rDNA oligonucleotide và phƣơng pháp PCR để phát hiện nấm Fusarium oxysporum. Kỹ thuật PCR và lai phân tử đƣợc phát triển để phát hiện Fusarium oxysporum. Các dữ liệu trên trình tự từ rRNA 28S, 2 primer (PFO2 và PFO3) và probe 20 – mer đƣợc thiết kế. Những oligonucleotide này đƣợc kiểm tra trên 16 dòng F. oxysporum và 80