Từ 30 – 45 chu kỳ Bƣớc 1: Biến tính Bƣớc 2: Bắt cặp Bƣớc 3: Nối dài
- Quá trình bắt cặp của primer: MgCl2 làm tăng khả năng bắt cặp chính xác của primer với DNA template.
- Sự đặc hiệu của sản phẩm PCR: bao gồm cả sự bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn và sự nối dài chính xác.
- Hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Thông thường hàm lượng ion Mg+
cần thiết từ 0,5 – 2.5 mM. Chu trình nhiệt:
Ban đầu thiết lập một giai đoạn nhiệt độ khoảng 94oC trong 5 phút để hầu như tất cả các đoạn DNA khuôn mạch đôi bị biến tính tách ra thành 2 DNA khuôn mạch đơn phân biệt và không tự bắt cặp lại với nhau.
Nhiệt độ biến tính: 94oC – 96oC trong 15 giây hay lâu hơn, các sản phẩm của chu kỳ PCR trước tiếp tục bị làm biến tính để thành DNA khuôn mạch đơn cho chu kỳ PCR tiếp theo.
Nhiệt độ bắt cặp: 55oC (50oC – 56oC) trong 30 giây. Nhiệt độ bắt cặp là quan trọng nhất, bảo đảm rằng không quá thấp (do dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu) và cũng không quá cao (dẫn đến khó bắt cặp hoàn toàn hay không bắt cặp).
Nhiệt độ nối dài: 72oC trong 90 giây. Thời gian kéo dài phải đủ để có thể kéo dài hoàn toàn một trình tự và hầu hết các đoạn DNA khuôn mạch đơn, nếu không sẽ dẫn đến những kết quả sai lầm do không đủ thời gian để nối dài.
Ba bước này lặp lại khoảng 30 – 45 chu kỳ.
Chu kì cuối cùng kết thúc bằng một khoảng thời gian nối dài ở 72o
C trong 5 phút. Sản phẩm PCR sau đó sẽ được bảo quản ở 4oC hay –20oC.
2.2.9.3. Tối ƣu hoá phản ứng PCR
Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR trên DNA của nhiều loại sinh vật khác nhau các nhà khoa học cần phải tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR bởi mỗi loại sinh vật có một đặc trưng riêng. Các biện pháp tối ưu đó liên quan đến những vấn đề:
Trình tự của primer: Theo nguyên tắc, primer càng dài sự bắt cặp càng chuyên biệt và ngược lại. Mục đích của việc thiết kế primer là có được sự cân bằng giữa sự chuyên tính (bắt cặp hoàn toàn bổ xung giữa những nucleotide của primer với những nucleotide của DNA template) và hiệu quả của PCR (tạo ra càng nhiều sản phẩm gần với lý thuyết tính toán càng tốt). Trình tự của primer xác định kích thước, vị trí của sản phẩm PCR và nhiệt độ Tm, giúp ước lượng được nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – 2 (thường chỉ đúng với những primer có chiều dài nhỏ hơn 20 basepairs).
Nhiệt độ bắt cặp: Ta = Tm – 2oC, trong đó:
Tm = 2oC x (A+T) + 4oC x (G+C) (Suggs và ctv, 1981)
Với A, T, G, C là số lượng các nucleotide tương ứng có trong chuỗi primer, tuy nhiên công thức này chỉ để tham khảo hay ước lượng.
Nồng độ MgCl2: ảnh hưởng lớn đến kết quả phản ứng, người ta thường thay đổi nồng độ của MgCl2 trước tiên để phản ứng xảy ra dễ dàng hơn.
Nồng độ các dNTP: mỗi dNTP thường khoảng 200 μM.
Những enzyme DNA polymerase chịu nhiệt: Nên sử dụng ở nồng độ 0,5 U/25 μl đủ để kiểm soát sự đặc hiệu của phản ứng PCR. Không nên sử dụng enzyme ở nồng độ cao hơn 2,5 nM (1,25 U/25 μl).
Chất ổn định hoạt động enzyme (enzyme stabilizer): thường là gelatin ở nồng độ 0,01 % hay Triston X – 100 ở nồng độ 0,1 % trong dung dịch buffer để tồn trữ DNA.
Nồng độ các primer: pimer F (forward primer) và primer R (reverse primer) phải có nồng độ bằng nhau và không nên dư thừa.
Tỉ lệ primer/DNA template: Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng dimer – primer sẽ xuất hiện do lượng DNA template thấp và lượng primer quá cao. Ngược lại sản phẩm PCR không nhiều do không đủ primer cho nhân bản.
Chƣơng 3