VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết và kiểm tra DNA lá điều
Phương pháp tách chiết: Tách chiết DNA dựa trên phương pháp của Doyle và Doyle (1988). Phương pháp này dựa vào tính chất của CTAB như đã trình bày. Quy trình tách chiết gồm 12 bước:
Bước 1: Cân 0,2.g lá đã rửa sạch cho vào cối nghiền mẫu, cho vào 1,2.ml dịch trích EB để nghiền lá với dung dịch này. Vortex kỹ. Ủ ở 65oC trong 45 phút.
Bước 2: Thêm 500 μl chloroform:isoamylalcohol (24:1), vortex 10 phút, li tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 10o
C.
Bước 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bước 2.
Bước 4: Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 μl RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ.
Bước 5: Thêm vào 250 μl dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200C trong khoảng 1 giờ (nên để qua đêm).
Bước 6: Ly tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 10oC. Đổ bỏ dịch trong. Bước 7: Cho vào 300 μl TE 1X, ủ 37oC trong 1 giờ.
Bước 8: Thêm 20 μl muối sodium acetate 3 M và 640 μl ethanol 96 % (hay 100 %), trộn đều và để –20oC trong 30 phút.
Bước 9: Ly tâm 10 phút 14.000 vòng/phút ở 10oC.
Bước 10: Rửa cặn với 400 μl ethanol 70 % bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng/phút ở 10oC. Đổ bỏ dịch trong.
Bước 11: Lặp lại bước 10, để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 μl TE 1 X, ủ ở 37oC trong 30 phút.
Bước 12: Bảo quản mẫu ở 4o
C.
Phương pháp kiểm tra DNA: Có 2 phương pháp kiểm tra DNA:
Phương pháp đo mật độ quang phổ: Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối chính xác lượng DNA cũng như chất lượng DNA có trong mẫu kết
quả thu được. Kết quả nếu giá trị tỉ số OD260 nm/OD280 nm trong khoảng 1,8 – 2,2 thì mẫu DNA tương đối sạch, có thể sử dụng được cho phản ứng PCR. Định lượng DNA theo công thức:
Lượng DNA (ng/μl) = ( 62,9 x OD260 nm –36 x OD280 nm) x n với “n” là hệ số pha loãng.
Phương pháp điện di: Phương pháp này cho phép ta đánh giá chất lượng DNA (có bị gãy nhiều hay không, có bẩn không,…) tuy nhiên không cho biết nồng độ của DNA thu được hay độ sạch của dung dịch DNA một cách chính xác. Điện di bằng gel agarose 1,0 %. Kết quả được đọc trên máy UV.