KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
TT1 TT7 TT13 TT27TT33 CĐ45CĐ50 CĐ
trung bình khoảng 70 – 80 ng/μl, có thể do lá điều có nhiều chất thứ cấp khác như polyphenol, polypeptide,…gây khó khăn cho quá trình tách chiết. Một số mẫu có nồng độ DNA rất thấp (khoảng 30 ng/μl trở xuống) đều là của những mẫu lá non hay những lá đã trưởng thành nhưng còn mềm.
Khó khăn: Khó tách DNA từ lá điều còn non. Trong 80 mẫu thực hiện có 25 mẫu lá non cho kết quả tách chiết DNA không tốt (giá trị OD cao hơn 1,8 nhưng nồng độ DNA rất thấp, khi điện di không thấy kết quả). Lặp lại việc tách 25 mẫu lá non trên khoảng 2 – 3 lần nhưng vẫn không cho kết quả. Điều này có thể do lá non đang trong thời kỳ sinh trưởng mạnh nên nồng độ các hợp chất thứ cấp nhiều, ảnh hưởng không tốt đến việc tách chiết DNA, ngoài ra trong lá non hàm lượng nước cao làm cho số lượng DNA trong lá non ít hơn lá trưởng thành (hình 4.2).
Hình 4.2 Kết quả tách chiết DNA lá điều tươi còn non Biện pháp khắc phục:
Đối với lá điều trưởng thành: Chúng tôi cũng đưa ra một số lưu ý khi thực hiện quá trình tách chiết:
- Bước 1: Bước này cần phải giữ cho lá không bị khô trước khi nghiền, công đoạn nghiền phải đều tay, không nghiền mạnh. Sử dụng
máy vortex khuấy trộn kỹ ở tốc độ thấp, khoảng 600 – 1.000 vòng/phút.
- Bước 2: Thêm 500 μl chloroform : isoamylalcohol (24:1), sau đó có thể dùng máy vortex khuấy trộn ở tốc độ thấp như bước 1 hay chỉ cần đảo nhẹ trong khoảng 10 phút để hạn chế gãy DNA.
- Bước 3: Chỉ nên hút khoảng 500 μl dịch ở bên trên, tránh chạm đầu tip vào phần ngăn cách giữa 2 pha vì đây là phần chứa nhiều protein bị loại bỏ.
- Bước 4: Chỉ nên hút khoảng 250 – 300 μl dịch trích.
- Bước 5: Thêm vào 250 μl dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –20oC trong khoảng 1 giờ (nên để qua đêm). Nên lấy tỉ lệ DNA : dung dịch isopropanol lạnh = 1 : 1.
- Bước7: Cho vào 300 μl TE 1 X, ủ 37oC trong 1 giờ. Có thể chỉ để khoảng 30 phút vì mục đích của bước này chỉ để cho DNA tan ra. - Bước 11: Lặp lại bước 10, để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 μl TE 1 X, ủ ở 37oC trong 30 phút, phải để thật khô, không còn ethanol trong kết tủa DNA do ethanol ảnh hưởng xấu tới DNA và phản ứng PCR.
Đối với lá điều non: Có thể tăng nồng độ các hóa chất có tác dụng làm kết tủa protein, peptide, polyphenol,…như CTAB, mercaptroethanol, chloroform,… và tăng lượng mẫu lá.
