KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.2.2.5. Kết quả thực hiện kỹ thuật PCR– RAPD trên các mẫu DNA thu đƣợc
đƣợc
Khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD với 50 mẫu DNA, kết quả có 41/50 mẫu có kết quả, đạt tỉ lệ 82 %. Những mẫu không có kết quả, khi so sánh với kết quả tách chiết DNA chúng tôi nhận thấy những mẫu này có nồng độ DNA rất thấp (dưới 30 ng/μl), vì vậy chúng tôi nghi ngờ rằng trong khi hút DNA để thực hiện PCR – RAPD, do nồng độ quá thấp nên đã không hút đủ lượng DNA cần thiết.
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT1 – TT13. Hình 4.7 là kết quả điện di các mẫu từ TT1 – TT13 cho thấy có 3 band đồng hình và 6 band đa hình. Band đồng hình là những band có ở tất cả các mẫu, band đa hình là những band có ở mẫu này mà không có ở mẫu kia. Trên hình 4.7 ta thấy mẫu TT1 không có band 750 base pairs, 2300 base pairs, TT5 không có band 1600 base pairs, TT6 không có band 1600 base pairs.
Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT14 – TT25 Từ hình 4.8 chúng tôi nhận thấy có mẫu TT24 và TT25 cho kết quả không tốt, vì vậy chúng tôi không sử dụng làm kết quả đánh giá đa dạng di truyền.
TT14 TT15 TT17TT19 TT21 TT22 TT24 TT25 La Kết quả PCR – RAPD không tốt
TT01 TT04 TT05 TT06 TT07 La TT08 TT09 TT10 TT11 TT12 TT13
Band khó xác định Band đa hình
Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT27 – XM79. Chúng tôi chia hình 4.9 ra thành 2 hình cho dễ phân tích: hình 4.9A và 4.9B.
Hình 4.9A Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT27–CD53. Khi sử dụng kỹ thuật RAPD với 11 primer để đánh giá tính đa dạng di truyền của các giống điều (Samal và ctv, 2002) thì với primer 11 đã thu được 11 band trong đó có 9 band đa hình và 2 band đồng hình, điều này chứng tỏ primer 11 cho kết quả có tính đa hình cao và khá ổn định [7] [15].
TT TT TT TT TT VT CD CD La CD CD CD CD BR BR BR CD 27 29 31 33 36 38 39 40 41 43 44 45 46 49 50 53
Hình 4.9B Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR– RAPD các mẫu từ XM61– M79. Vì một số band khó nhận biết bằng mắt thường nên chúng tôi sử dụng công cụ Detectband của phần mềm Quantity One 4.2.1 trong máy Geldoc để phát hiện band.
Hình 4.10 Màn hình phát hiện band các kết quả PCR – RAPD.
Chúng tôi đã phát hiện được 3/11 band đồng hình, chiếm tỉ lệ khoảng 27,3 % tổng số các band được phát hiện, có độ dài khoảng 550 base pairs, 900 base pairs và 1050 base pairs.
La CĐ CĐ CĐ CĐ BR BR BR TT La XM XM XM XM XMXMXMXM a 41 43 44 45 46 49 50 53 61 64 70 72 76 77 78 79
Đối với tất cả các mẫu đã thực hiện thành công phản ứng PCR – RAPD có 8/11 band đa hình được phát hiện, chiếm tỉ lệ 72,7 % tổng số các band được phát hiện. Đặc điểm của các band đa hình được trình bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Các band đa hình và mối liên quan với các đặc điểm của cây lấy mẫu.
Các band Số lƣợng mẫu có Những đặc điểm chung của những cây có tạo band đa hình
600 base pairs 17/41 mẫu, tỉ lệ 41 %.
Có đến 16/17 mẫu là của những cây cho rất nhiều hoa, ra hoa sớm và năng suất rất cao, vì vậy chúng tôi giả thuyết có thể band 600base pairs là chỉ thị phân tử của những tính trạng ra hoa sớm, rất nhiều hoa và năng suất rất cao.
700 base pairs 2/41 mẫu, tỉ lệ 5 %.
Mẫu CĐ39 và CĐ41 giống nhau và khá đặc biệt so với những mẫu khác, trong đó có tính trạng trái đỏ, rất ngon nhưng ít hạt. Chúng tôi giả định có thể band 700base pairs này là chỉ thị của tính trạng trái đỏ và rất ngon.
750 base pairs 35/41 mẫu, tỉ lệ 85 %. Chưa xác định.
1200 base pairs 25/41 mẫu, tỉ lệ 61 %. Chưa xác định.
1400 base pairs 27/41 mẫu, tỉ lệ 66 %. Chưa xác định.
1600 base pairs 26/41 mẫu, tỉ lệ 63 %. Chưa xác định.
1900 base pairs 35/41 mẫu, tỉ lệ 85 %. Chưa xác định.
2300 base pairs 30/41 mẫu, tỉ lệ 73 %. Chưa xác định.
Khi điện di bằng gel agarose, độ dài của các band sẽ không thật sự chính xác do những hạn chế của gel agarose. Những band trên bản điện di có thể không hoàn toàn bằng nhau nhưng không thể phát hiện bằng mắt thường. Có thể giải trình tự của
những band đa hình này để biết chính xác độ dài và trình tự của chúng có thật sự bằng nhau hay không. Trong 8 band đa hình mà chúng tôi phát hiện được, các band 600 base pairs, 700 base pairs là 2 band rất đáng quan tâm, có thể giải trình tự và sử dụng như những chỉ thị phân tử để phân biệt những cây có những tính trạng đáng quan tâm (thống kê ở bảng 4.3).