- Mẫu phân: dùng tăm bông vô trùng lấy phân trực tiếp từ trực tràng của bê, nghé nghi nhiễm vi khuẩn E. coli.
- Mẫu phủ tạng: sau khi mổ khám cắt một phần tổ chức gan, lách, ruột non, ruột già, máu tim cho vào từng lọ riêng biệt.
Tất cả các loại mẫu đều được bảo quản lạnh từ 2 - 80C, ghi chép đầy đủ các thông tin trên phiếu bệnh phẩm và nhãn bệnh phẩm, đảm bảo giống nhau giữa nhãn và phiếu bệnh phẩm, giữ trong thùng bảo ôn và gửi nhanh về phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Nếu phòng thí nghiệm ở xa gửi về phòng xét nghiệm chậm nhất 48 giờ sau lấy mẫu.
2.4.3. Phương pháp phân lập và xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli E.coli
2.4.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli
thạch máu và thạch MacConkey. Bồi dưỡng ở tủ ấm 370C trong 24 giờ. Sau đó chọn khuẩn lạc điển hình, làm tiêu bản trên phiến kính, nhuộm Gram, xem hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn. TiÕp tôc nuôi cấy thuần vi khuẩn
E. coli phân lập được.
Sơ đồ Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn E. coli ở bê nghé
(Phương pháp thường quy thực hiện tại Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y)
* Phương pháp kiểm tra:
- Phương pháp phết kính:
Dùng que cấy vô trùng, lấy một giọt nước sinh lý để vào phiến kính sạch, Môi trường thạch máu
MacConkey
Phát hiện các yếu tố gây bệnh Phản ứng PCR
Bệnh do vi khuẩn E. coli gây ra
Kháng sinh đồ để chọn loại kháng sinh thích hợp điều trị
Giám định vi khuẩn E. coli Thạch máu Phản ứng ngưng kết nhanhtrên phiến kính Xác định các serotype kháng nguyên O Mẫu bệnh phẩm từ bê, nghé do mắc bệnh tiêu chảy Chọn khuẩn lạc thuần
dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc điển hình vi khuẩn E. coli, hoà tan phần khuẩn lạc đã cấy vào giọt nước sinh lý trên phiến kính, cố định tiêu bản trên ngọn đèn cồn bằng phương pháp hơ trao (không để tiêu bản sát ngọn đèn cồn).
Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram:
+ Bước 1: Nhỏ dung dịch tím Gemxian lên chỗ cố định vi khuẩn, để 1 - 2 phút, rửa sạch bằng nước, vẩy khô.
+ Bước 2: Nhỏ dung dịch lugol để 1 phút, rửa nước, vẩy khô.
+ Bước 3: Đổ cồn 960 chảy qua thật nhanh chỗ phết vi khuẩn đến khi không còn nhuộm màu nữa, rửa sạch bằng nước, vẩy khô.
+ Bước 4: Nhỏ dung dịch fucsin để 1 phút, rửa nước, vẩy khô.
Dùng giấy thấm thấm khô nước, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học bằng vật kính dầu với độ phóng đại 100x, quan sát thấy vi khuẩn bắt màu gram âm, vi khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn.
2.4.3.2. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn E.coli
Sử dụng phương pháp Koch, mẫu được pha loãng ở nồng độ b, cấy 0,2 ml vào thạch đặc rồi đếm khuẩn lạc (CFU) trên máy đếm.
Số lượng vi khuẩn X trong 1gam phân được tính theo công thức: X = 5 x a x b
Trong đó:
a: là số lượng CFU trung bình trên một đĩa Petri b: Độ pha loãng mẫu; hệ số 5: Vì cấy 0,2ml
2.4.3.3. Giám định một số đặc tính sinh hoá chủ yếu của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập
*Phản ứng sinh Indon:
- Nguyên lý: trong môi trường không có đường mà chỉ có peptone, một số vi khuẩn sản sinh men Tryptophataza làm phân giải Trytophan để sinh Indon.
- Cách tiến hành:
Cấy khuẩn lạc vào môi trường có nước peptone hay môi trường có chứa tryptophan, nuôi ở 37°C từ 18 đến 24 giờ. Nhỏ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử
Kovacs vào môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn, quan sát trong vòng 1 phút. - Đánh giá kết quả:
+ Phản ứng dương tính: trên bề mặt môi trường xuất hiện một vòng tròn màu đỏ.
Tryptophan Indon
Indon + P.dimetylaminobenzaldehyt Rosindon (màu đỏ) + Phản ứng âm tính: môi trường không chuyển màu.
* Phản ứng lên men sinh hơi đường
- Thành phần của dung dịch peptone: Peptone : 15 g Nước cất vô trùng : 1000 ml - Cách tiến hành:
Trong 100 ml môi trường peptone cho vào 1 ml chỉ thị màu Andrader, lắc đều rồi chia ra các ống nghiệm. Mỗi ống 5 ml có ống Duyham (để kiểm tra sinh hơi của vi khuẩn).
Pha các loại đường Glucoza, Lactoza... thành dung dịch 10%, 20%, hấp ướt 1100C trong vòng 20-30 phút.
Cho vào mỗi ống môi trường nước peptone 5-6 giọt dung dịch đường 10%, 20%. Để tủ ấm 370C trong 24 giờ, kiểm tra có tạp khuẩn thì loại bỏ thay thế bằng ống môi trường khác. Sau đó cấy vi khuẩn cần giám định vào rồi bồi dưỡng ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ.
- Đánh giá kết quả: cùng một lúc kiểm tra được 2 tính chất: + Phản ứng lên men đường:
Phản ứng dương tính: môi trường chuyển thành màu hồng đỏ. Phản ứng âm tính: môi trường không chuyển màu.
+ Phản ứng sinh hơi:
Phản ứng dương tính: ống Duyham bị đẩy lên và trong ống có một khoảng khí.
Phản ứng âm tính: ống Duyham vẫn ở đáy ống nghiệm, trong ống không có gì.
2.4.3.4. Xác định type của vi khuẩn E.coli phân lập được
Xác định bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. Vi khuẩn
E.coli có nhiều Serotype O khác nhau, do vậy bước quan trọng đầu tiên là xác định nhóm Serotype O, sau đó tiến hành phản ứng ngưng kết với các kháng huyết thanh đơn giá trong nhóm cần xác định. Những nguyên liệu cơ bản cho việc định tuýpe gồm:
+ Các chủng vi khuẩn E.coli cần định type được giữ trên thạch máu. + Các kháng huyết thanh O chuẩn (đa giá và đơn giá)
* Phương pháp tiến hành như sau:
Trên phiến kính sạch, nhỏ 2 giọt nước muối sinh lý hai vị trí riêng rẽ, dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn E.coli cần định type từ thạch đĩa nuôi cấy, trộn đều khuẩn lạc vào nước sinh lý ở phiến kính tạo thành huyễn dịch vô trùng. Dùng que cấy vô trùng lấy một giọt kháng huyết thanh đa giá hoà vào huyễn dịch vi khuẩn trên phiến kính, huyễn dịch còn lại không nhỏ kháng huyết thanh, đọc kết quả sau vài giây. Phản ứng dương tính: khi huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh tạo hạt ngưng kết trên phiến kính, huyễn dịch trở nên trong, mức độ dương tính tính từ mức 1 (+) cho tới 4 (+). Phản ứng âm tính: huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đục đều, không có hạt ngưng kết.
- Phản ứng dương tính khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với kháng huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước trong. Với phản
ứng ngưng kết sảy ra nhanh, rõ rệt đánh giá ở mức 4 (+), nếu quá trình diễn ra chậm sự ngưng kết không nhiều... tùy theo khả năng ngưng kết để dánh giá mức độ ngưng kết khác nhau.
- Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh nhóm để định type. Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều đơn giá khác nhau, ta phải thực hiện pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất.
2.4.3.5. Xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. Coli phân lập được
* Phương pháp xác định khả năng dung huyết của vi khuẩn E.coli phân lập được nuôi cấy trên môi trường thạch máu
Vi khuần E.coli phân lập được cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu thỏ, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ, sau đó để ra ngoài ở điều kiện nhiệt độ bình thường của phòng thí nghiệm khoảng từ 2 - 3 giờ để dung huyết diễn ra hoàn toàn. Căn cứ vào đặc điểm dung huyết làm cơ sở đánh giá kiểu dung huyết:
- Nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết trong suốt là kiểu dung huyết .
- Nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết mờ, tiếp tục để ở 370C trong 18 giờ nữa vòng dung huyết sáng sạch, đó là kiểu dung huyết .
- Nếu xung quanh khuẩn lạc không có vòng dung huyết thì vi khuẩn không có khả năng dung huyết hoặc dung huyết kiểu .
* Xác định các loại độc tố (ST, LT) và các loại kháng nguyên bám dính F4 (K88), F5( K99), F6 (987P, F18 bằng phương pháp PCR
- Nguyên liệu:
+ Các chủng vi khuẩn E. coli chuẩn quốc tế, dùng làm đối chứng dương (đã được kiểm định chắc chắn có mang các gen quy định các yếu tố độc lực), bao gồm: FD617 (F4), FD520 (F6), FD521 (F5), FD634 (F4/LT/STa/STb), FD635 (VT1/VT2/eae), FD638 (F4/LT/STb), FD639 (STa/STb/VT2e/F18) và FD527 (đối chứng âm).
+ Các loại mồi (primer)( mồi ngược và mồi xuôi) dùng để xác định các gen quy định sinh độc tố (STa, STb, LT, VT2e) và yếu tố bám dính (F4, F5, F6, F41, F18) do hãng Life Technologies (Gibco, BRL) sản xuất và được bảo quản ở -200C.
- Phương pháp:
+ DNA của chủng vi khuẩn cần kiểm tra: khuẩn lạc vi khuẩn E. coli mọc trên môi trường thạch máu ở 370C trong 24 giờ.
+ Hỗn hợp cho một phản ứng PCR: Mồi : 1 µl Dung dịch đệm (5X) : 5.0 µl Enzym (Taq polymerase) : 0.05 µl
Nước cất khử ion vừa đủ để đạt được thể tích cuối cùng là 25 µl cho 1 phản ứng.
+ Chu trình của 1 phản ứng PCR:
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và được thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer, theo quy trình sau:
- Chạy điện di:
Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye), được trộn vào mẫu theo tỷ lệ 1:5.
Bảng 2.1: Các chu trình của phản ứng PCR Loại fimbriae hoặc độc tố cần xác định Chu trình thứ nhất
C¸c chu trình tiếp theo Chu trình cuối Biến tính (0C/phút) Biến tính (0C/phút) Gắn mồi (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) Tổng hợp (0C/phút) F4, F5, F6, STa, STb, LT 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 F18 94/5 94/1 50/1 72/1 72/7 Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch Agarose 3% trong dung dịch đệm TAE (Tris - acetate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong 40 phút. Đây là cách để cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp.
Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các phân tử acid nucleic trong môi trường pH trung tính thì tích điện âm nhờ các nhóm phốt phát nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tích trên thạch Agarose, các phân tử acid nucleic tuỳ theo các kích thước sẽ chuyển dịch với tốc độ khác nhau: loại có kích thước phân tử lớn chạy chậm, loại có kích thước phân tử bé chuyển dịch nhanh hơn.
- Nhuộm:
Gel thạch sau khi chạy điện di được nhuộm màu bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium bromide (1µl/ml) trong 15 phút và được quan sát dưới đèn tử ngoại. BEt là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trí cố định của các nhóm có khoảng cách gần với bazơ tạo ra một lượng huỳnh quang lớn rất nhiều so với các phân tử BEt tự do. BEt sử dụng bằng cách trộn với mẫu, cho vào đệm điện di
(0.5 µl/ml), cho vào thạch (0.5µl/ml) hoặc nhuộm sau khi điện di xong (1 µl/ml).
- Đọc kết quả:
Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới ánh đèn UV (300 nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Polaroid camera. Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn acid nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại.
Kích thước các băng DNA được so sánh với DNA chuẩn (DNA marker) (giếng M), được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một lỗ riêng biệt, cạnh các lỗ dùng phát hiện các sản phẩm PCR.
Nhờ chỉ thị dây truyền này mà người ta có thể xác định được độ dài của đoạn sản phẩm PCR.